Evaluierung des Zelltods mit zellfreiem Überstand von Probiotika in dreidimensionalen sphäroiden Kulturen von Darmkrebszellen
Summary
Hier werden Methoden vorgestellt, um die krebshemmende Wirkung von Lactobacillus cell-free superstandant (LCFS) zu verstehen. Darmkrebs-Zelllinien zeigen Zelltod, wenn sie mit LCFS in 3D-Kulturen behandelt werden. Der Prozess der Erzeugung von Sphäroiden kann je nach Gerüst optimiert werden und die vorgestellten Analysemethoden sind nützlich, um die beteiligten Signalwege zu bewerten.
Abstract
Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Bewertung des Krebszelltodes in dreidimensionalen (3D) Sphäroiden mehrzelliger Krebsarten unter Verwendung von Überständen aus der Lactobacillus fermentum Zellkultur, die als Probiotika-Kulturen betrachtet werden. Die Verwendung von 3D-Kulturen zum Testen von Lactobacillus zellfreiem Überstand (LCFS) ist eine bessere Option als tests in 2D-Monoschichten, zumal L. fermentum Krebsbekämpfungseffekte im Darm hervorrufen kann. Es wurde festgestellt, dass L. fermentum-Überstand unter 3D-Kulturbedingungen eine erhöhte antiproliferative Wirkung gegen mehrere Darmkrebszellen (CRC) besitzt. Interessanterweise waren diese Effekte stark mit dem Kulturmodell verbunden, was die bemerkenswerte Fähigkeit von L. fermentum zeigte, den Tod von Krebszellen zu induzieren. Stabile Sphäroide wurden aus verschiedenen CRCs (Darmkrebszellen) unter Verwendung des unten vorgestellten Protokolls erzeugt. Dieses Protokoll zur Erzeugung von 3D-Sphäroid ist zeitsparend und kostengünstig. Dieses System wurde entwickelt, um die krebshemmenden Wirkungen von LCFS in mehreren Arten von CRC-Sphäroiden leicht zu untersuchen. Wie erwartet, induzierten CRC-Sphäroide, die mit LCFS behandelt wurden, während des Experiments stark den Zelltod und exprimierten spezifische apoptose-molekulare Marker, die durch qRT-PCR, Western Blotting und FACS-Analyse analysiert wurden. Daher ist diese Methode wertvoll für die Erforschung der Zelllebensfähigkeit und die Bewertung der Wirksamkeit von Krebsmedikamenten.
Introduction
Probiotika sind die vorteilhaftesten Mikroorganismen im Darm, die die Immunhomöostase und den Energiestoffwechsel verbessern1. Probiotika aus Lactobacillus und Bifidobacterium sind die fortschrittlichsten ihrer Art, die im Darm gefunden werden2,3. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass Lactobacillus hemmende und antiproliferative Wirkungen auf mehrere Krebsarten hat, einschließlich Darmkrebs4. Darüber hinaus verhindern Probiotika entzündliche Darmerkrankungen, Morbus Crohn und Colitis ulcerosa5,6. Die meisten Studien mit Probiotika wurden jedoch in zweidimensionalen (2D) Monoschichten durchgeführt, die auf festen Oberflächen gezüchtet werden.
Künstlichen Kultursystemen fehlen Umweltmerkmale, was für Krebszellen nicht natürlich ist. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurden dreidimensionale (3D) Kultursysteme entwickelt7,8. Krebszellen in 3D zeigen Verbesserungen in Bezug auf grundlegende biologische Mechanismen wie Zelllebensfähigkeit, Proliferation, Morphologie, Zell-Zell-Kommunikation, Arzneimittelempfindlichkeit und In-vivo-Relevanz9,10. Darüber hinaus werden Sphäroide aus mehrzelligen Arten von Darmkrebs hergestellt und sind abhängig von Zell-Zell-Interaktionen und der extrazellulären Matrix (ECM)11. Unsere vorherige Studie hat berichtet, dass probiotische zellfreie Überstände (CFS), die mit Lactobacillus fermentum hergestellt wurden, krebshemmende Wirkungen auf 3D-Kulturen von Darmkrebszellen (CRC) zeigten12. Wir schlugen vor, dass CFS eine geeignete alternative Strategie zum Testen probiotischer Wirkungen auf 3D-Sphäroideist 12.
Hier stellen wir einen Ansatz vor, der mehrzellige Arten von 3D-Darmkrebs für die Analyse der therapeutischen Wirkungen von probiotischen zellfreien Überständen (CFS) auf mehrere 3D-Darmkrebs-Mimikrysysteme aufnehmen kann. Diese Methode bietet ein Mittel zur Analyse verwandter probiotischer und krebshemmenden Wirkungen in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Gewebemikroumgebung, einschließlich benachbarter Zellen und der extrazellulären Matrix (ECM), ist grundlegend für die Gewebeerzeugung und entscheidend für die Kontrolle des Zellwachstums und der Gewebeentwicklung13. 2D-Kulturen haben jedoch mehrere Nachteile, wie die Störung zellulärer Interaktionen sowie Veränderungen in der Zellmorphologie, extrazellulären Umgebungen und dem Ansatz derDivision 14. 3D-Zellkultursysteme wurden gründlich untersucht, um In-vivo-E…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch die “Etablierung von Messstandards für Chemie und Strahlung”, Förderkennzeichen KRISS-2020-GP2020-0003, und “Entwicklung von Messstandards und -technologien für Biomaterialien und medizinische Konvergenz”, Förderkennzeichen KRISS-2020-GP2020-0004 Programme, finanziert vom Korea Research Institute of Standards and Science, unterstützt. Diese Forschung wurde auch vom Ministerium für Wissenschaft und IKT (MSIT), der National Research Foundation of Korea (NRF-2019M3A9F3065868), dem Ministerium für Gesundheit und Wohlfahrt (MOHW), dem Korea Health Industry Development Institute (KHIDI, HI20C0558), dem Ministerium für Handel, Industrie und Energie (MOTIE) und dem Korea Evaluation Institute of Industrial Technology (KEIT, 20009350) unterstützt. ORCID ID (Hee Min Yoo: 0000-0002-5951-2137; Dukjin Kang: 0000-0002-5924-9674; Seil Kim: 0000-0003-3465-7118; Joo-Eun Lee: 0000-0002-2495-1439; Jina Lee: 0000-0002-3661-3701). Wir danken Chang Woo Park für die Unterstützung bei experimenten.
Materials
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 15-well, 15 µl |
Biorad | 4561036 | Pkg of 10 |
| Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | 100 covers |
| 10x transfer buffer | Intron | IBS-BT031A | 1 L |
| 10X Tris-Glycine (W/SDS) | Intron | IBS-BT014 | 1 L |
| Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube, Polypropylene, Clear, Nonsterile, 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case | Corning | SCT-200-C | 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case |
| BD Difco Bacto Agar | BD | 214010 | 500 g |
| BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | DF0881-17-5 | 500 g |
| CellTiter-Glo 3D Cell viability assay | Promega | G9681 | 100μl/assay in 96-well plates |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | vial of 20 tablets |
| Corning Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium, PH 7.4 ± 0.1 | Corning | 21-040-CV | 500 mL |
| EMD Millipore Immobilon-P PVDF Transfer Membranes | fisher Scientific | IPVH00010 | 26.5cm x 3.75m roll; Pore Size: 0.45um |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 25/Pack, 500/Case |
| Fetal Bovine Serum, certified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | 500 mL |
| iScript cDNA Synthesis Kit, 25 x 20 µl rxns #1708890 | Biorad | 1708890 | 25 x 20 µL rxns |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Biorad | 1725121 | 5 x 1 mL |
| Lactobacillus fermentum | Korean Collection for Type Cultures | KCTC 3112 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C6852-25G | 25 g |
| Methyl Cellulose (3500-5600mPa·s, 2% in Water at 20°C) | TCI | M0185 | 500 g |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346906 | 20 plates |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized | Millipore | SLGS033SB | 250 |
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD | Biolegend | 640934 | 100 tests |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Introgen | P1304MP | 100 mg |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermo Fisher Scientific | 89901 | 250 mL |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen | 74106 | 250 |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-119 | 500 mL |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | 100 mL |
| Name of Materials/Equipment/Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| anti – p-IκBα (B-9) | Santa cruze | sc-8404 | 200 µg/mL |
| anti-BclxL (H-5) | Santa cruze | sc-8392 | 200 µg/mL |
| anti-PARP 1 (C2-10) | Santa cruze | sc-53643 | 50 µl ascites |
| anti-β-actin (C4) | Santa cruze | sc-47778 | 200 µg/mL |
| BD FACSVerse | BD Biosciences | San Diego, CA, USA | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioT | S1LFA | |
| CO2 incubator | Thermo fisher | HERAcell 150i | |
| Conical tube 15 ml | SPL | 50015 | |
| Conical tube 50 ml | SPL | 50050 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS7007 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3471 | |
| Costar 50 mL Reagent Reservoirs, 5/Bag, Sterile | Costar | 4870 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermofisher | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | invitrogen | AMQAF1000 | |
| EnSpire Multimode Reader | Perkin Elmer | Enspire 2300 | |
| Eppendorf Research Plus Multi Channel Pipette, 8-channel | Eppendorf | 3122000051 | |
| FlowJo software | TreeStar | Ashland, OR, USA | |
| Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 115-035-062 | 1.5 mL |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 111-035-144 | 2.0 mL |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad Software | Inc., San Diego, CA, USA | |
| ImageJ | NIH | ||
| ImageQuant LAS 4000 mini | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| Incubated shaker | Lab companion | SIF-6000R | |
| Multi Gauge Ver. 3.0, | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| Optical density (OD)LAMBDA UV/Vis Spectrophotometers | Perkin Elmer | Waltham, MA, USA | |
| Phase-contrast microscope | Olympus | Tokyo, Japan | |
| SPL microcentrifuge tube 1.5mL | SPL | 60015 | |
| SPL Multi Channel Reservoirs, 12-Chs, PS, Sterile | SPL | 21012 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | Waltham, MA, USA | |
| Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processors | SONICS-vibra cell | VC 505 | 500 Watt ultrasonic processor |
| Vinyl Anaerobic Chamber | COY LAB PRODUCTS |
Riferimenti
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