Avaliação da morte celular usando supernanato livre de células de probióticos em culturas esferoides tridimensionais de células cancerígenas colorretais
Summary
Aqui são apresentados métodos para entender os efeitos anticânculos do supernatante livre de células Lactobacillus (LCFS). As linhas de células cancerígenas colorretais mostram mortes celulares quando tratadas com LCFS em culturas 3D. O processo de geração de esferoides pode ser otimizado dependendo do andaime e os métodos de análise apresentados são úteis para avaliar as vias de sinalização envolvidas.
Abstract
Este manuscrito descreve um protocolo para avaliar as mortes de células cancerígenas em esferoides tridimensionais (3D) de tipos multicelulares de células cancerígenas usando supernacantes da cultura celular fermentum Lactobacillus, consideradas culturas probióticas. O uso de culturas 3D para testar o supernante livre de células Lactobacillus (LCFS) é uma opção melhor do que testar em monocamadas 2D, especialmente porque l. fermentum pode produzir efeitos anti-câncer dentro do intestino. L. fermentum supernante foi identificado por possuir efeitos anti-proliferativos aumentados contra várias células de câncer colorretal (CRC) em condições de cultura 3D. Curiosamente, esses efeitos estavam fortemente relacionados com o modelo de cultura, demonstrando a notável capacidade de L. fermentum para induzir a morte celular cancerígena. Esferoides estáveis foram gerados a partir de diversos CRCs (células cancerosas colorretais) utilizando o protocolo apresentado abaixo. Este protocolo de geração de spheroid 3D é uma economia de tempo e rentável. Este sistema foi desenvolvido para investigar facilmente os efeitos anticâncológicos do LCFS em vários tipos de spheroids CRC. Como esperado, os spheróides crc tratados com LCFS induziram fortemente a morte celular durante o experimento e expressaram marcadores moleculares específicos de apoptose, conforme analisado por qRT-PCR, manchas ocidentais e análise FACS. Portanto, este método é valioso para explorar a viabilidade celular e avaliar a eficácia de medicamentos anticâncológicos.
Introduction
Os probióticos são os microrganismos mais vantajosos no intestino que melhoram a homeostase imunológica e o metabolismo energético hospedeiro1. Os probióticos de Lactobacillus e Bifidobacterium são os mais avançados do seu tipo encontrados no intestino2,3. Investigações anteriores mostraram que Lactobacillus tem efeitos inibitórios e antiproliferativos em vários cânceres, incluindo câncer colorretal4. Além disso, os probióticos previnem doenças inflamatórias intestinais, doença de Crohn e colite ulcerativa5,6. No entanto, a maioria dos estudos com probióticos foram realizados em monocamadas bidimensionais (2D) cultivadas em superfícies sólidas.
Sistemas de cultura artificial carecem de características ambientais, o que não é natural para células cancerosas. Para superar essa limitação, foram desenvolvidos sistemas de cultura tridimensionais (3D)7,8. Células cancerígenas em 3D apresentam melhorias em termos de mecanismos biológicos básicos, como viabilidade celular, proliferação, morfologia, comunicação celular, sensibilidade a medicamentos e relevância in vivo9,10. Além disso, os esferoides são feitos de tipos multicelulares de câncer colorretal e dependem de interações célula-células e da matriz extracelular (ECM)11. Nosso estudo anterior relatou que o supernaente probiótico livre de células (CFS) produzido usando o fermentum Lactobacillus mostrou efeitos anticânculos nas culturas 3D das células de câncer colorretal (CRC)12. Propusemos que o CFS é uma estratégia alternativa adequada para testar efeitos probióticos em esferoides 3D12.
Aqui, apresentamos uma abordagem que pode acomodar tipos multicelulares de câncer colorretal 3D para a análise de efeitos terapêuticos de supernanato probiótico livre de células (CFS) em vários sistemas de imitação de câncer colorretal 3D. Este método fornece um meio para a análise de efeitos probióticos e anticâncicos relacionados in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
O microambiente tecidual, incluindo células vizinhas e a matriz extracelular (ECM), é fundamental para a geração de tecidos e crucial no controle do crescimento celular e desenvolvimento de tecidos13. No entanto, as culturas 2D têm diversas desvantagens, como a interrupção das interações celulares, bem como alterações na morfologia celular, ambientes extracelulares e a abordagem da divisão14. Os sistemas de cultura celular 3D foram rigorosamente estudados para m…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pelo “Estabelecimento de padrões de medição para Química e Radiação”, número de subvenção KRISS-2020-GP2020-0003, e “Desenvolvimento de Padrões de Medição e Tecnologia para Biomateriais e Convergência Médica”, número de subvenção KRISS-2020-GP2020-0004, financiado pelo Korea Research Institute of Standards and Science. Esta pesquisa também contou com o apoio do Ministério da Ciência e TIC (MSIT), Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF-2019M3A9F3065868), Ministério da Saúde e Bem-Estar (MOHW), Instituto de Desenvolvimento da Indústria da Saúde da Coreia (KHIDI, HI20C0558), Ministério do Comércio, Indústria & Energia (MOTIE) e Instituto de Avaliação da Coreia de Tecnologia Industrial (KEIT, 20009350). ID ORCID (Hee Min Yoo: 0000-0002-5951-2137; Dukjin Kang: 0000-0002-5924-9674; Seil Kim: 0000-0003-3465-7118; Joo-Eun Lee: 0000-0002-2495-1439; Jina Lee: 0000-0002-3661-3701). Agradecemos ao Parque Chang Woo pela ajuda com experimentos.
Materials
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 15-well, 15 µl |
Biorad | 4561036 | Pkg of 10 |
| Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | 100 covers |
| 10x transfer buffer | Intron | IBS-BT031A | 1 L |
| 10X Tris-Glycine (W/SDS) | Intron | IBS-BT014 | 1 L |
| Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube, Polypropylene, Clear, Nonsterile, 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case | Corning | SCT-200-C | 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case |
| BD Difco Bacto Agar | BD | 214010 | 500 g |
| BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | DF0881-17-5 | 500 g |
| CellTiter-Glo 3D Cell viability assay | Promega | G9681 | 100μl/assay in 96-well plates |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | vial of 20 tablets |
| Corning Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium, PH 7.4 ± 0.1 | Corning | 21-040-CV | 500 mL |
| EMD Millipore Immobilon-P PVDF Transfer Membranes | fisher Scientific | IPVH00010 | 26.5cm x 3.75m roll; Pore Size: 0.45um |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 25/Pack, 500/Case |
| Fetal Bovine Serum, certified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | 500 mL |
| iScript cDNA Synthesis Kit, 25 x 20 µl rxns #1708890 | Biorad | 1708890 | 25 x 20 µL rxns |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Biorad | 1725121 | 5 x 1 mL |
| Lactobacillus fermentum | Korean Collection for Type Cultures | KCTC 3112 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C6852-25G | 25 g |
| Methyl Cellulose (3500-5600mPa·s, 2% in Water at 20°C) | TCI | M0185 | 500 g |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346906 | 20 plates |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized | Millipore | SLGS033SB | 250 |
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD | Biolegend | 640934 | 100 tests |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Introgen | P1304MP | 100 mg |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermo Fisher Scientific | 89901 | 250 mL |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen | 74106 | 250 |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-119 | 500 mL |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | 100 mL |
| Name of Materials/Equipment/Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| anti – p-IκBα (B-9) | Santa cruze | sc-8404 | 200 µg/mL |
| anti-BclxL (H-5) | Santa cruze | sc-8392 | 200 µg/mL |
| anti-PARP 1 (C2-10) | Santa cruze | sc-53643 | 50 µl ascites |
| anti-β-actin (C4) | Santa cruze | sc-47778 | 200 µg/mL |
| BD FACSVerse | BD Biosciences | San Diego, CA, USA | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioT | S1LFA | |
| CO2 incubator | Thermo fisher | HERAcell 150i | |
| Conical tube 15 ml | SPL | 50015 | |
| Conical tube 50 ml | SPL | 50050 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS7007 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3471 | |
| Costar 50 mL Reagent Reservoirs, 5/Bag, Sterile | Costar | 4870 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermofisher | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | invitrogen | AMQAF1000 | |
| EnSpire Multimode Reader | Perkin Elmer | Enspire 2300 | |
| Eppendorf Research Plus Multi Channel Pipette, 8-channel | Eppendorf | 3122000051 | |
| FlowJo software | TreeStar | Ashland, OR, USA | |
| Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 115-035-062 | 1.5 mL |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 111-035-144 | 2.0 mL |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad Software | Inc., San Diego, CA, USA | |
| ImageJ | NIH | ||
| ImageQuant LAS 4000 mini | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| Incubated shaker | Lab companion | SIF-6000R | |
| Multi Gauge Ver. 3.0, | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| Optical density (OD)LAMBDA UV/Vis Spectrophotometers | Perkin Elmer | Waltham, MA, USA | |
| Phase-contrast microscope | Olympus | Tokyo, Japan | |
| SPL microcentrifuge tube 1.5mL | SPL | 60015 | |
| SPL Multi Channel Reservoirs, 12-Chs, PS, Sterile | SPL | 21012 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | Waltham, MA, USA | |
| Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processors | SONICS-vibra cell | VC 505 | 500 Watt ultrasonic processor |
| Vinyl Anaerobic Chamber | COY LAB PRODUCTS |
Riferimenti
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