Оценка гибели клеток с использованием бесклеточного супернатанта пробиотиков в трехмерных сфероидных культурах колоректальных раковых клеток
Summary
Здесь представлены методы для понимания противораковых эффектов lactobacillus бесклеточного супернатанта (LCFS). Линии клеток колоректального рака показывают гибель клеток при лечении LCFS в 3D-культурах. Процесс генерации сфероидов может быть оптимизирован в зависимости от каркаса, а представленные методы анализа полезны для оценки задействованных сигнальных путей.
Abstract
В этой рукописи описан протокол оценки гибели раковых клеток в трехмерных (3D) сфероидах многоклеточных типов раковых клеток с использованием супернатантов из клеточной культуры Lactobacillus fermentum, рассматриваемой как культуры пробиотиков. Использование 3D-культур для тестирования безклеточного супернатанта Lactobacillus (LCFS) является лучшим вариантом, чем тестирование в 2D-монослоях, тем более что L. fermentum может производить противораковые эффекты в кишечнике. Было выявлено, что супернатант L. fermentum обладает повышенными антипролиферативными эффектами против нескольких клеток колоректального рака (CRC) в условиях 3D-культуры. Интересно, что эти эффекты были тесно связаны с моделью культуры, демонстрируя заметную способность L. fermentum индуцировать гибель раковых клеток. Стабильные сфероиды были получены из различных КРЦ (колоректальных раковых клеток) с использованием протокола, представленного ниже. Этот протокол генерации 3D-сфероида экономит время и экономична. Эта система была разработана для легкого исследования противораковых эффектов LCFS в нескольких типах сфероидов CRC. Как и ожидалось, сфероиды CRC, обработанные LCFS, сильно индуцировали гибель клеток во время эксперимента и экспрессировали специфические молекулярные маркеры апоптоза, проанализированные qRT-PCR, западным блоттингом и анализом FACS. Поэтому этот метод ценен для изучения жизнеспособности клеток и оценки эффективности противораковых препаратов.
Introduction
Пробиотики являются наиболее выгодными микроорганизмами в кишечнике, которые улучшают иммунный гомеостаз и энергетический обмен хозяина1. Пробиотики из Lactobacillus и Bifidobacterium являются самыми передовыми в своем роде, обнаруженными в кишечнике2,3. Предыдущие исследования показали, что Lactobacillus оказывает ингибирующее и антипролиферативное действие на несколько видов рака, включая колоректальный рак4. Кроме того, пробиотики предотвращают воспалительные заболевания кишечника, болезнь Крона и язвенный колит5,6. Однако большинство исследований с пробиотиками проводились в двухмерных (2D) монослоях, которые выращиваются на твердых поверхностях.
Системы искусственных культур не имеют особенностей окружающей среды, что не является естественным для раковых клеток. Для преодоления этого ограничения были разработаны трехмерные (3D) системы культур7,8. Раковые клетки в 3D показывают улучшения с точки зрения основных биологических механизмов, таких как жизнеспособность клеток, пролиферация, морфология, клеточно-клеточная связь, чувствительность к лекарственным средствам и актуальность in vivo9,10. Кроме того, сфероиды производятся из многоклеточных типов колоректального рака и зависят от клеточно-клеточных взаимодействий и внеклеточного матрикса (ECM)11. Наше предыдущее исследование показало, что пробиотический бесклеточный супернатант (CFS), полученный с использованием Lactobacillus fermentum, показал противораковые эффекты на 3D-культурах клеток колоректального рака (CRC)12. Мы предположили, что CFS является подходящей альтернативной стратегией для тестирования пробиотических эффектов на 3D-сфероидах12.
Здесь мы представляем подход, который может приспособить многоклеточные типы 3D-колоректального рака для анализа терапевтических эффектов пробиотического бесклеточного супернатанта (CFS) на нескольких системах 3D-мимикрии колоректального рака. Этот метод предоставляет средства для анализа связанных пробиотических и противораковых эффектов in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Микроокружение тканей, включая соседние клетки и внеклеточный матрикс (ECM), имеет основополагающее значение для генерации тканей и имеет решающее значение для контроля роста клеток и развития тканей13. Однако 2D-культуры имеют ряд недостатков, таких как нарушение клеточных ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано «Установлением эталонов для химии и радиации», номер гранта KRISS-2020-GP2020-0003 и «Разработка стандартов измерений и технологий для биоматериалов и медицинской конвергенции», грант No KRISS-2020-GP2020-0004, финансируемый Корейским научно-исследовательским институтом стандартов и науки. Это исследование также было поддержано Министерством науки и ИКТ (MSIT), Национальным исследовательским фондом Кореи (NRF-2019M3A9F3065868), Министерством здравоохранения и социального обеспечения (MOHW), Корейским институтом развития индустрии здравоохранения (KHIDI, HI20C0558), Министерством торговли, промышленности и энергетики (MOTIE) и Корейским институтом оценки промышленных технологий (KEIT, 20009350). ORCID ID (Хи Мин Ю: 0000-0002-5951-2137; Дукджин Кан: 0000-0002-5924-9674; Сейл Ким: 0000-0003-3465-7118; Джу-Ын Ли: 0000-0002-2495-1439; Джина Ли: 0000-0002-3661-3701). Благодарим Чанг Ву Парк за помощь в проведении экспериментов.
Materials
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 15-well, 15 µl |
Biorad | 4561036 | Pkg of 10 |
| Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | 100 covers |
| 10x transfer buffer | Intron | IBS-BT031A | 1 L |
| 10X Tris-Glycine (W/SDS) | Intron | IBS-BT014 | 1 L |
| Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube, Polypropylene, Clear, Nonsterile, 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case | Corning | SCT-200-C | 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case |
| BD Difco Bacto Agar | BD | 214010 | 500 g |
| BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | DF0881-17-5 | 500 g |
| CellTiter-Glo 3D Cell viability assay | Promega | G9681 | 100μl/assay in 96-well plates |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | vial of 20 tablets |
| Corning Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium, PH 7.4 ± 0.1 | Corning | 21-040-CV | 500 mL |
| EMD Millipore Immobilon-P PVDF Transfer Membranes | fisher Scientific | IPVH00010 | 26.5cm x 3.75m roll; Pore Size: 0.45um |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 25/Pack, 500/Case |
| Fetal Bovine Serum, certified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | 500 mL |
| iScript cDNA Synthesis Kit, 25 x 20 µl rxns #1708890 | Biorad | 1708890 | 25 x 20 µL rxns |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Biorad | 1725121 | 5 x 1 mL |
| Lactobacillus fermentum | Korean Collection for Type Cultures | KCTC 3112 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C6852-25G | 25 g |
| Methyl Cellulose (3500-5600mPa·s, 2% in Water at 20°C) | TCI | M0185 | 500 g |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346906 | 20 plates |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized | Millipore | SLGS033SB | 250 |
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD | Biolegend | 640934 | 100 tests |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Introgen | P1304MP | 100 mg |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermo Fisher Scientific | 89901 | 250 mL |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen | 74106 | 250 |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-119 | 500 mL |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | 100 mL |
| Name of Materials/Equipment/Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| anti – p-IκBα (B-9) | Santa cruze | sc-8404 | 200 µg/mL |
| anti-BclxL (H-5) | Santa cruze | sc-8392 | 200 µg/mL |
| anti-PARP 1 (C2-10) | Santa cruze | sc-53643 | 50 µl ascites |
| anti-β-actin (C4) | Santa cruze | sc-47778 | 200 µg/mL |
| BD FACSVerse | BD Biosciences | San Diego, CA, USA | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioT | S1LFA | |
| CO2 incubator | Thermo fisher | HERAcell 150i | |
| Conical tube 15 ml | SPL | 50015 | |
| Conical tube 50 ml | SPL | 50050 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS7007 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3471 | |
| Costar 50 mL Reagent Reservoirs, 5/Bag, Sterile | Costar | 4870 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermofisher | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | invitrogen | AMQAF1000 | |
| EnSpire Multimode Reader | Perkin Elmer | Enspire 2300 | |
| Eppendorf Research Plus Multi Channel Pipette, 8-channel | Eppendorf | 3122000051 | |
| FlowJo software | TreeStar | Ashland, OR, USA | |
| Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 115-035-062 | 1.5 mL |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 111-035-144 | 2.0 mL |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad Software | Inc., San Diego, CA, USA | |
| ImageJ | NIH | ||
| ImageQuant LAS 4000 mini | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| Incubated shaker | Lab companion | SIF-6000R | |
| Multi Gauge Ver. 3.0, | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| Optical density (OD)LAMBDA UV/Vis Spectrophotometers | Perkin Elmer | Waltham, MA, USA | |
| Phase-contrast microscope | Olympus | Tokyo, Japan | |
| SPL microcentrifuge tube 1.5mL | SPL | 60015 | |
| SPL Multi Channel Reservoirs, 12-Chs, PS, Sterile | SPL | 21012 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | Waltham, MA, USA | |
| Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processors | SONICS-vibra cell | VC 505 | 500 Watt ultrasonic processor |
| Vinyl Anaerobic Chamber | COY LAB PRODUCTS |
Riferimenti
- Bron, P. A., Van Baarlen, P., Kleerebezem, M. Emerging molecular insights into the interaction between probiotics and the host intestinal mucosa. Nature Reviews Microbiology. 10 (1), 66-78 (2012).
- Ruiz, L., Delgado, S., Ruas-Madiedo, P., Sánchez, B., Margolles, A. Bifidobacteria and their molecular communication with the immune system. Frontiers in Microbiology. 8, 1-9 (2017).
- Sanders, M. E., Merenstein, D. J., Reid, G., Gibson, G. R., Rastall, R. A. Probiotics and prebiotics in intestinal health and disease: from biology to the clinic. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (10), 605-616 (2019).
- Pandey, K. R., Naik, S. R., Vakil, B. V. Probiotics, prebiotics and synbiotics- a review. Journal of Food Science and Technology. 52 (12), 7577-7587 (2015).
- Harish, K., Varghese, T. Probiotics in humans-evidence based review. Calicut Medical Journal. 4 (4), 3 (2006).
- Routy, B., et al. The gut microbiota influences anticancer immunosurveillance and general health. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (6), 382-396 (2018).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. Most of the cell-based data-harvesting efforts that drive the integration of cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Jong, B. K. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
- Anton, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: A breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Sciences. 16 (3), 5517-5527 (2015).
- Lee, J. E., et al. Characterization of the Anti-Cancer Activity of the Probiotic Bacterium Lactobacillus fermentum Using 2D vs. 3D Culture in Colorectal Cancer Cells. Biomolecules. 9 (10), 557 (2019).
- Koledova, Z. 3D cell culture: An introduction. Methods in Molecular Biology. 1612, (2017).
- Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures – a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 1-14 (2018).
- Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: The missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Mazzocchi, A. R., Rajan, S. A. P., Votanopoulos, K. I., Hall, A. R., Skardal, A. In vitro patient-derived 3D mesothelioma tumor organoids facilitate patient-centric therapeutic screening. Scientific Reports. 8, 2886 (2018).
- Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
- Thirumala, S., Gimble, J., Devireddy, R. Methylcellulose Based Thermally Reversible Hydrogel System for Tissue Engineering Applications. Cells. 2 (3), 460-475 (2013).
- Chandrashekran, A., et al. Methylcellulose as a scaffold in the culture of liver-organoids for the potential of treating acute liver failure. Cell and Gene Therapy Insights. 4 (11), 1087-1103 (2018).
- Lee, W., Park, J. 3D patterned stem cell differentiation using thermo-responsive methylcellulose hydrogel molds. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
- Fan, H., Demirci, U., Chen, P. Emerging organoid models: Leaping forward in cancer research. Journal of Hematology and Oncology. 12 (1), 1-10 (2019).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Liou, C. S., et al. A Metabolic Pathway for Activation of Dietary Glucosinolates by a Human Gut Symbiont. Cell. 180 (4), 717-728 (2020).
- Sherwin, E., Bordenstein, S. R., Quinn, J. L., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Microbiota and the social brain. Science. 366 (6465), 2016 (2019).
- Honda, K., Littman, D. R. The microbiota in adaptive immune homeostasis and disease. Nature. 535 (7610), 75-84 (2016).
- Bárcena, C., et al. Healthspan and lifespan extension by fecal microbiota transplantation into progeroid mice. Nature Medicine. 25 (8), 1234-1242 (2019).
- Michalovich, D., et al. Obesity and disease severity magnify disturbed microbiome-immune interactions in asthma patients. Nature Communications. 10, 5711 (2019).
- Ansaldo, E., et al. Akkermansia muciniphila induces intestinal adaptive immune responses during homeostasis. Science. 364 (6446), 1179-1184 (2019).
