JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimica

التصوير البلوري بالأشعة السينية لدراسة انتقال الدولة أوليغومريك من Thermotoga maritima M42 أمينوببتيداسي TmPep1050

Published: May 13, 2020
doi:
10.3791/61288
, , ,
1Laboratory of Microbiology, Department of Molecular Biology,Université Libre de Bruxelles, 2Labiris Institut de Recherche

Summary

وقد تم تطوير هذا البروتوكول لدراسة التحول dimer-dodecamer من TmPep1050، M42 aminopeptidase، على المستوى الهيكلي. وهو خط أنابيب مباشر يبدأ من تنقية البروتين إلى معالجة بيانات الأشعة السينية. وقد تم التأكيد على كريستالودينسيس، فهرسة مجموعة البيانات، واستبدال الجزيئية من خلال حالة من الدراسة، TmPep1050H60A H307A البديل.

Abstract

تشكل M42 aminopeptidases مجمعات نشطة وظيفيًا مصنوعة من 12 وحدة فرعية. ويبدو أن عملية التجميع الخاصة بهم تخضع للتنظيم من قبل العوامل المساعدة في أيونات المعادن مما يؤدي إلى انتقال أكثر ظُنًا. عند ربط أيونات المعادن، تحدث عدة تعديلات هيكلية في الموقع النشط وعلى واجهة التفاعل، وتشكيل الخافتات لتعزيز التجمع الذاتي. ولمراقبة هذه التعديلات، يجب عزل القلة المستقرة قبل إجراء دراسة هيكلية. ذكرت هنا هو الأسلوب الذي يسمح لتنقية dodecamers مستقرة وdamers من TmPep1050, M42 aminopeptidase من T. maritima, وتحديد هيكلها بواسطة التصوير البلوري بالأشعة السينية. تم إعداد الديممرات من dodecamers عن طريق إزالة الأيونات المعدنية مع عامل chelating. دون عاملهم المساعد، أصبحت dodecamers أقل استقرارا وتم فصلها تماما عند التدفئة. تم حل الهياكل القلة من خلال نهج الاستبدال الجزيئي المباشر. لتوضيح المنهجية ، يتم عرض هيكل متغير TmPep1050 ، ضعيف تمامًا في ربط الأيونات المعدنية ، يظهر عدم وجود مزيد من الأعطال من الخافضات إلى مونومرات.

Introduction

10- التنشئة القلائية هي عملية سائدة تملي الوظائف البيولوجية للعديد من البروتينات. في الإشريكية القولونية، ويقدر أن 35٪ فقط من البروتينات هيأحادية 1. بعض البروتينات، ودعا morpheeins، يمكن أن تعتمد حتى العديد من الدول القلة مع وحدات فرعية وجود بنية متميزة في كل دولة أوليغومريك2. الانتقال بين حالاتهم القلة غالبا ما يعني تنظيم نشاط البروتين حيث أن كل ولاية من الدول القلة قد يكون لها نشاط أو وظيفة مختلفة محددة. وقد تم توثيق العديد من الأمثلة على morpheeins جيدا في الأدب ، لا سيما في الporphobilinogen synthase3, HPr kinase /phosphatase4, لون بروتياز5, لاكتات dehydrogenase6, الجلسرينالدهيدي -3-الفوسفات dehydrogenase7, بيروفات كيناز8, سيترات synthase9, وpponuclease A10. في الآونة الأخيرة، وصفنا M42 aminopeptidase TmPep1050، مثال آخر من الانزيم مع سلوك مثل مورفيين، الذي يعتمد نشاطه على الدول القلةلها 11. ويتوسط الانتقال بين دولها القلة من قبل العوامل المساعدة المعدنية التي تحفز العديد من التعديلات الهيكلية لالوحدات الفرعية.

تنتمي عائلة M42 aminopeptidase إلى عشيرة MH12,13, ويتم توزيعها على نطاق واسع بين البكتيريا والارشمية14. و M42 aminopeptidases هي إنزيمات دينوكليار حقيقية الببتيدات المهينة تصل إلى 35 بقايا الأحماض الأمينية في طول15. أنها تعتمد على هيكل غريب على شكل رباعي الهيدرون مصنوعة من 12 وحدات فرعية مع مواقعهم النشطة الموجهة نحو تجويف داخلي. وكثيرا ما يوصف مثل هذا الترتيب بأنه تقسيم نانو للنشاط لتجنب انحلال البروتيل غير المنضبط. قد تكون مرتبطة الوظيفة الفسيولوجية من أمينوببتيداسيس M42 مع البروتيم، الببتيدات التحلل الناجمة عن تدهور البروتين16،17. Pyrococcus horikoshii تمتلك أربعة M42 أمينوببتيداسيس، كل عرض خصوصيات متميزة ولكن متكاملة18,19,20,21. فريد, وقد وصفت هيتيروكوميكس مصنوعة من نوعين مختلفين من الوحدات الفرعية في p. horikoshii, مما يشير إلى وجود مجمعات ببتيداسوم22,23.

وقد وصفت عدة هياكل من M42 أمينوببتيداسيس في الأدب11،16،18،19،20،24،25،26. وتتألف هذه الunit من مجالين مختلفين، مجال حفاز ومجال اتم. المجال الحفاز يعتمد α المشتركة / β أضعاف محفوظة في عشيرة MH كله، والمجال الحفاز الأركيولوجية يجري أمينوببتيداز Ap1 من فيبريو proteolyticus27. يعتمد المجال الديمّر طية تشبه PDZ16 وقد يكون لها دور في oligomerization ، بالإضافة إلى دورها في التحكم في الوصول الركازة والتجليد في التجويف الداخلي11. كما اللبنة الأساسية هو أكثر خافة، وغالبا ما يوصف dodecamer بأنها رابطة من ستة خافمات، كل خافض يجري وضعها في كل حافة من tetrahedron16. يعتمد احتكار أعضاء M42 aminopeptidases على توافر العوامل المساعدة المعدنية. أيونات المعادن المبرومة، وغالباً ما زن2 + وCo2+، وتشارك بشكل تحفيزي في الربط الببتيد والتحلل المائي. وهي موجودة في موقعين مختلفين للربط، وهما موقعي M1 و M2. أيونات معدنية اثنين أيضا محرك وصقل االتائح كما هو موضح لPhTET2، PhTET3، PfTET3، وTmPep105011،24،28،29. عندما تنضب العوامل المساعدة المعدنية، وdedecamer تفكيك في العتيمات، كما هو الحال في PhTET2، PhTET3، وTmPep105011،16،28، أو حتى مونومرات، كما هو الحال في PhTET2 وPfteT324،29.

هنا هو بروتوكول يستخدم لدراسة هياكل oligomers TmPep1050. هذا البروتوكول هو مجموعة من الطرق الشائعة بما في ذلك تنقية البروتين، وفحص نشاط البروتيوليك، والتبلور، وانعراج الأشعة السينية، والاستبدال الجزيئي. وأكد على الدقة الكامنة في التعامل مع metalloenzymes، oligomerization البروتين، وبلورة البروتين واستبدال الجزيئية. كما يتم عرض حالة من الدراسة لإظهار ما إذا كان dodecamers TmPep1050 قد تتفكك إلى مونومرات أم لا. لمعالجة هذا السؤال، تم دراسة متغير TmPep1050، TmPep1050H60A H307A، مواقع ربط المعادن التي تضعف من قبل تحور له -60 (موقع M2) وه – 307 (موقع M1) إلى بقايا علاء. قد يتم استيعاب هذا البروتوكول لدراسة أخرى M42 أمينوببتيداسيس أو أي metalloenzymes مع سلوك مثل morpheein.

Protocol

1. إنتاج وتنقية من TmPep1050 المؤتلف ملاحظة: ويرد أدناه وصف إجراء الاستنساخ وتنقية من نوع البرية TmPep1050 مقتبس من دراسة سابقة11. وبدلاً من ذلك، يمكن إجراء الاستنساخ باستخدام جين اصطناعي. لتوليد المتغيرات TmPep1050، يمكن تنفيذ الطفرات الموقع الموجهة التالية، على سبيل المثال?…

Representative Results

لدراسة احتمال تفكك dodecamer في مونومر في TmPep1050، تم استبدال codons له-60 و 307 له من قبل الين كودون باستخدام جين الاصطناعية. ثم تم استنساخ هذا الجين في ناقلات pBAD للتعبير وتنقية من البديل TmPep1050 المقابلة اسمه لاحقا TmPep1050H60A H307A. أظهر الكروماتوغرافيا استبعاد الحجم (الشكل 3B) أن البروت?…

Discussion

البروتوكول الموصوف هنا يسمح بفهم انتقال dimer-dodecamer من TmPep1050 على المستوى الهيكلي. وقد شهدت منهجية سابقا لتحديد هيكل كل من oligomers TmPep105011. وكانت الخطوة الأكثر تحديا هي إيجاد ظروف تعزز تفكك الـddecamers إلى خافضات مستقرة. وكان على هذه الظروف أن تكون خفيفة بما يكفي للسماح بإعادة دمج الخافت?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر مارتين رووفر على تصحيح هذه الورقة وتقديم تعليقات بناءة. كان الوصول إلى خط الشعاع Proxima 2 (SOLEIL synchrotron) ضمن مجموعات تخصيص الكتلة 20151139.

Materials

1,10-phenanthroline Sigma-Aldrich 13, 137-7
Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K Merck Millipore UFC503096
Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K Merck Millipore UFC903024
Benzonase Nuclease Merck Millipore 70664-3
CCP4 N/A visit http://www.ccp4.ac.uk/
cOmplete EDTA-free Roche 5056489001
Coot N/A visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/
Crystal Screen I Hampton Research HR2-110
Crystal Screen II Hampton Research HR2-112
DreamTaq Green PCR Master Mix ThermoFisher Scientific K1082
EasyXtal 15-well tool NeXtal 132007
Escherichia coli PPY strain N/A see reference 31
Escherichia coli XL1 blue strain Agilent 200249
Gel Filtration Calibration Kit HMW GE Healthcare Life Sciences 28-4038-42
Gel Filtration Calibration Kit LMW GE Healthcare Life Sciences 28-4038-41
Gel Filtration Standard Biorad 1511901
GeneJET Plasmid Miniprep Kit ThermoFisher Scientific K0503
Index Hampton Research HR2-144
Litholoops Molecular Dimensions
L-leucine-p-nitroanilide Bachem AG 40010720025
Natrix 1 Hampton Research HR2-116
Natrix 2 Hampton Research HR2-117
Neggia plugin Dectris N/A visit https://www.dectris.com/
NeXtal Tubes JCSG Core Suite I NeXtal 130724
NeXtal Tubes JCSG Core Suite II NeXtal 130725
NeXtal Tubes JCSG Core Suite III NeXtal 130726
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV NeXtal 130727
pBAD-TOPO ThermoFisher Scientific K430001
Phenix N/A visit https://www.phenix-online.org/
Phusion High-Fidelity DNA polymerase ThermoFisher Scientific F-530L
Salt RX 1 Hampton Research HR2-107
Salt RX 2 Hampton Research HR2-109
SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO ThermoFisher Scientific 88242
Source 15Phe GE Healthcare Life Sciences 17014702
Source 15Q GE Healthcare Life Sciences 17094705
Superdex 200 prep grade GE Healthcare Life Sciences 17104301
Thermotoga maritima MSB8 strain American Type Culture Collection ATCC 43589
TmCD00089984 DNASU Plasmid Repository N/A
XDS N/A visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/
xdsme N/A visit https://github.com/legrandp/xdsme
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Levy, E. D., Teichmann, S. A. Structural, Evolutionary, and Assembly Principles of Protein Oligomerization. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 117, 25-51 (2013).
  2. Selwood, T., Jaffe, E. K. Dynamic dissociating homo-oligomers and the control of protein function. Archives of Biochemistry and Biophysics. 519 (2), 131-143 (2012).
  3. Jaffe, E. K. The Remarkable Character of Porphobilinogen Synthase. Accounts of Chemical Research. 49 (11), 2509-2517 (2016).
  4. Ramström, H., et al. Properties and Regulation of the Bifunctional Enzyme HPr Kinase/Phosphatase in Bacillus subtilis. Journal of Biological Chemistry. 278 (2), 1174-1185 (2003).
  5. Rudyak, S. G., Brenowitz, M., Shrader, T. E. Mg2+-Linked Oligomerization Modulates the Catalytic Activiy of the Lon (La) Protease from Mycobacterium smegmatis. Biochimica. 40 (31), 9317-9323 (2001).
  6. Yamamoto, S., Storey, K. B. Dissociation-Association of lactate dehydrogenase Isozymes: Influences on the formation of tetramers vs. dimers of M4-LDH and H4-LDH. International Journal of Biochemistry. 20 (11), 1261-1265 (1988).
  7. Sirover, M. A. Structural analysis of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase functional diversity. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 57, 20-26 (2014).
  8. Gupta, V., Bamezai, R. N. K. Human pyruvate kinase M2: A multifunctional protein: Multifunctional Human PKM2. Protein Science. 19 (11), 2031-2044 (2010).
  9. Wiegand, G., Remington, S. J. Citrate synthase: Structure, Control, and Mechanism. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).
  10. Libonati, M., Gotte, G. Oligomerization of bovine ribonuclease A: structural and functional features of its multimers. Biochemical Journal. 380 (2), 311-327 (2004).
  11. Dutoit, R., et al. How metal cofactors drive dimer-dodecamer transition of the M42 aminopeptidase TmPep1050 of Thermotoga maritima. Journal of Biological Chemistry. 294 (47), 17777-17789 (2019).
  12. Rawlings, N. D., et al. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Research. 46 (1), 624-632 (2018).
  13. Neuwald, A. F., Liu, J. S., Lipman, D. J., Lawrence, C. E. Extracting protein alignment models from the sequence database. Nucleic Acids Research. 25 (9), 1665-1677 (1997).
  14. Dutoit, R., Brandt, N., Legrain, C., Bauvois, C. Functional Characterization of Two M42 Aminopeptidases Erroneously Annotated as Cellulases. PLoS ONE. 7 (11), 50639 (2012).
  15. Franzetti, B., et al. Tetrahedral aminopeptidase: a novel large protease complex from archaea. The EMBO Journal. 21 (9), 2132-2138 (2002).
  16. Borissenko, L., Groll, M. Crystal Structure of TET Protease Reveals Complementary Protein Degradation Pathways in Prokaryotes. Journal of Molecular Biology. 346 (5), 1207-1219 (2005).
  17. Appolaire, A., et al. TET peptidases: A family of tetrahedral complexes conserved in prokaryotes. Biochimie. 122, 188-196 (2016).
  18. Russo, S., Baumann, U. Crystal Structure of a Dodecameric Tetrahedral-shaped Aminopeptidase. Journal of Biological Chemistry. 279 (49), 51275-51281 (2004).
  19. Schoehn, G., et al. An Archaeal Peptidase Assembles into Two Different Quaternary Structures: A tetrahedron and a giant octahedron. Journal of Biological Chemistry. 281 (47), 36327-36337 (2006).
  20. Durá, M. A., et al. The structural and biochemical characterizations of a novel TET peptidase complex from Pyrococcus horikoshii reveal an integrated peptide degradation system in hyperthermophilic Archaea: Characterization of P. horikoshii TET3 peptidase. Molecular Microbiology. 72 (1), 26-40 (2009).
  21. Basbous, H., Appolaire, A., Girard, E., Franzetti, B. Characterization of a Glycyl-Specific TET Aminopeptidase Complex from Pyrococcus horikoshii. Journal of Bacteriology. 200 (17), 00059 (2018).
  22. Appolaire, A., et al. Small-angle neutron scattering reveals the assembly mode and oligomeric architecture of TET, a large, dodecameric aminopeptidase. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 70 (11), 2983-2993 (2014).
  23. Appolaire, A., et al. The TET2 and TET3 aminopeptidases from P yrococcus horikoshii form a hetero-subunit peptidasome with enhanced peptide destruction properties: TET aminopeptidase multi-subunit complex. Molecular Microbiology. 94 (4), 803-814 (2014).
  24. Colombo, M., Girard, E., Franzetti, B. Tuned by metals: the TET peptidase activity is controlled by 3 metal binding sites. Scientific Reports. 6 (1), 20876 (2016).
  25. Petrova, T. E., et al. Structure of the dodecamer of the aminopeptidase APDkam598 from the archaeon Desulfurococcus kamchatkensis. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (3), 277-285 (2015).
  26. Kim, D., et al. Structural basis for the substrate specificity of PepA from Streptococcus pneumoniae, a dodecameric tetrahedral protease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 391 (1), 431-436 (2010).
  27. Chevrier, B., et al. Crystal structure of Aeromonas proteolytica aminopeptidase: a prototypical member of the co-catalytic zinc enzyme family. Structure. 2, 283-291 (1994).
  28. Rosenbaum, E., Ferruit, M., Durá, M. A., Franzetti, B. Studies on the parameters controlling the stability of the TET peptidase superstructure from Pyrococcus horikoshii revealed a crucial role of pH and catalytic metals in the oligomerization process. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1814 (10), 1289-1294 (2011).
  29. Macek, P., et al. Unraveling self-assembly pathways of the 468-kDa proteolytic machine TET2. Science Advances. 3 (4), 1601601 (2017).
  30. Edelheit, O., Hanukoglu, A., Hanukoglu, I. Simple and efficient site-directed mutagenesis using two single-primer reactions in parallel to generate mutants for protein structure-function studies. BMC Biotechnology. 9 (1), 61 (2009).
  31. Zhang, Y., Werling, U., Edelmann, W. SLiCE: a novel bacterial cell extract-based DNA cloning method. Nucleic Acids Research. 40 (8), 55 (2012).
  32. Schleif, R. AraC protein, regulation of the l-arabinose operon in Escherichia coli, and the light switch mechanism of AraC action. FEMS Microbiology Reviews. 34 (5), 779-796 (2010).
  33. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).
  34. Bergfors, T. Seeds to crystals. Journal of Structural Biology. 142 (1), 66-76 (2003).
  35. Dauter, Z. Collection of X-Ray Diffraction Data from Macromolecular Crystals. Protein Crystallography. 1607, 165-184 (2017).
  36. Powell, H. R. X-ray data processing. Bioscience Reports. 37 (5), 0227 (2017).
  37. Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. iMOSFLM a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 271-281 (2011).
  38. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).
  39. Clabbers, M. T. B., Gruene, T., Parkhurst, J. M., Abrahams, J. P., Waterman, D. G. Electron diffraction data processing with DIALS. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74 (6), 506-518 (2018).
  40. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  41. Legrand, P. . legrandp/xdsme: March 2019 version working with the latest XDS version. , (2019).
  42. Evans, P. Scaling and assessment of data quality. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (1), 72-82 (2006).
  43. Wlodawer, A., Minor, W., Dauter, Z., Jaskolski, M. Protein crystallography for non-crystallographers, or how to get the best (but not more) from published macromolecular structures: Protein crystallography for non-crystallographers. FEBS Journal. 275 (1), 1-21 (2008).
  44. Karplus, P. A., Diederichs, K. Assessing and maximizing data quality in macromolecular crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 34, 60-68 (2015).
  45. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 325-338 (2010).
  46. Rossmann, M. G., Blow, D. M. The detection of sub-units within the crystallographic asymmetric unit. Acta Crystallographica. 15, 24-31 (1962).
  47. Rossmann, M. G. The molecular replacement method. Acta Crystallographica Section A Foundations of Crystallography. 46 (2), 73-82 (1990).
  48. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674 (2007).
  49. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 213-221 (2010).
  50. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).
  51. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (1), 12-21 (2010).
  52. Zwart, P. H., Grosse-Kunstleve, R. W., Lebedev, A. A., Murshudov, G. N., Adams, P. D. Surprises and pitfalls arising from (pseudo)symmetry. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (1), 99-107 (2008).
  53. Yeates, T. O. Detecting and overcoming crystal twinning. Methods in Enzymology. 276, 344-358 (1997).
  54. Terwilliger, T. C. Using prime-and-switch phasing to reduce model bias in molecular replacement. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 60 (12), 2144-2149 (2004).
  55. Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (1), 61-69 (2008).
  56. Krissinel, E., Henrick, K. Inference of Macromolecular Assemblies from Crystalline State. Journal of Molecular Biology. 372 (3), 774-797 (2007).

Tags

Keywords: X-ray CrystallographyOligomeric StateThermotoga MaritimaAminopeptidaseTmPep1050Activity AssayApoenzyme PreparationDialysisUltrafiltration
check_url/it/61288?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Dutoit, R., Brandt, N., Van Elder, D., Droogmans, L. X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050. J. Vis. Exp. (159), e61288, doi:10.3791/61288 (2020).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image