Este protocolo ha sido desarrollado para estudiar la transición dimer-dodecamer de TmPep1050, un M42 aminopeptidasa, a nivel estructural. Es una tubería sencilla que va desde la purificación de proteínas hasta el procesamiento de datos de rayos X. La cristalgénesis, la indexación de conjuntos de datos y el reemplazo molecular se han enfatizado a través de un caso de estudio, la variante TmPep1050H60A H307A.
Los aminopeptidases M42 forman complejos funcionalmente activos hechos de 12 subunidades. Su proceso de montaje parece estar regulado por sus cofactores de iones metálicos que desencadenan una transición dimer-dodecamer. Tras la unión de iones metálicos, se producen varias modificaciones estructurales en el sitio activo y en la interfaz de interacción, dando forma a los dimers para promover el autoensamble. Para observar tales modificaciones, los oligómeros estables deben aislarse antes del estudio estructural. Reportado aquí es un método que permite la purificación de dodecamers estables y dimers de TmPep1050, un M42 aminopeptidasa de T. maritima,y su determinación de la estructura por cristalografía de rayos X. Los dimers se preparaban a partir de dodecamers mediante la eliminación de iones metálicos con un agente quelante. Sin su cofactor, los dodecamers se volvieron menos estables y se disociaron por completo al calentarse. Las estructuras oligoméricas fueron resueltas por el enfoque de reemplazo molecular sencillo. Para ilustrar la metodología, la estructura de una variante TmPep1050, totalmente deteriorada en la unión de iones metálicos, se presenta mostrando ninguna descomposición adicional de dimers a monómeros.
La oligomerización es un proceso predominante que dicta las funciones biológicas de muchas proteínas. En Escherichia coli, se estima que sólo el 35% de las proteínas son monoméricas1. Algunas proteínas, llamadas morfeínas, pueden incluso adoptar varios estados oligoméricos con subunidades que tienen una estructura distinta en cada estado oligomérico2. La transición entre sus estados oligoméricos es a menudo un medio para regular la actividad proteica ya que cada estado oligomérico puede tener una actividad o función específica diferente. Varios ejemplos de morfeeeinas han sido bien documentados en la literatura, en particular el porphobilinogen synthase3, HPr kinasa/phosphatase4, Lon proteasa5, lactato deshidrogenasa6, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa7, pirateuvasa8, cito de lactato9, y ribonusa10 . Recientemente, describimos el M42 aminopeptidasa TmPep1050, otro ejemplo de enzima con comportamiento similar a la morfeína, cuya actividad depende de sus estados oligoméricos11. La transición entre sus estados oligoméricos está mediada por sus cofactores metálicos que inducen varias modificaciones estructurales de las subunidades.
La familia M42 aminopeptidasa pertenece al clan MH12,13,y se distribuye ampliamente entre Bacterias y Archaea14. Los aminopeptidases M42 son enzimas dinucleares genuinas degradando péptidos hasta 35 residuos de aminoácidos en longitud15. Adoptan una peculiar estructura en forma de tetraedro hecha de 12 subunidades con sus sitios activos orientados hacia una cavidad interna. Tal disposición se describe a menudo como una nano-compartimentación de la actividad para evitar la proteólisis incontrolada. La función fisiológica de las aminopeptidasas M42 puede estar asociada con el proteosoma, péptidos hidrolizantes resultantes de la degradación de proteínas16,17. Pyrococcus horikoshii posee cuatro Aminopeptidases M42, cada uno presentando especificidades distintas pero complementarias18,19,20,21. Singularmente, heterocomplejos hechos de dos tipos diferentes de subunidades se han descrito en P. horikoshii, sugiriendo la existencia de complejos peptidasome22,23.
Varias estructuras de M42 aminopeptidases se han descrito en la literatura11,16,18,19,20,24,25,26. La subunidad se compone de dos dominios distintos, un dominio catalítico y un dominio de dimerización. El dominio catalítico adopta un pliegue común α/β conservado en todo el clan MH, siendo el dominio catalítico arquetípico la aminopeptidasa Ap1 de Vibrio proteolyticus27. El dominio de dimerización adopta un pliegue similar a laPDS 16 y puede tener, además de su papel en la oligomerización, un papel en el control del acceso al sustrato y la unión en la cavidad interna11. Como el bloque de construcción básico es un dimer, el dodecamer se describe a menudo como la asociación de seis dimers, cada dimer se coloca en cada borde del tetraedro16. La oligomerización de los aminopeptidases M42 depende de la disponibilidad de sus cofactores metálicos. Los iones metálicos divalentes, a menudo Zn2+ y Co2+,participan catalíticamente en la unión a péptidos y la hidrólisis. Se encuentran en dos sitios de enlace distintos, a saber, los sitios M1 y M2. Los dos iones metálicos también conducen y afinan finamente la oligomerización como se demuestra para PhTET2, PhTET3, PfTET3 y TmPep105011,24,28,29. Cuando se agotan los cofactores metálicos, el dodecamer se desmonta en dimers, como en PhTET2, PhTET3, y TmPep105011,16,28,o incluso monómeros, como en PhTET2 y PfTET324,29.
Aquí se presenta un protocolo utilizado para estudiar las estructuras de los oligómeros TmPep1050. Este protocolo es un conjunto de métodos comunes que incluyen purificación de proteínas, cribado de actividad proteolítica, cristalización, difracción de rayos X y reemplazo molecular. Se enfatizan las sutilezas inherentes al tratamiento de las metaloenzimas, la oligomerización de proteínas, la cristalización de proteínas y el reemplazo molecular. También se presenta un caso de estudio para mostrar si los dodecamers TMPep1050 pueden disociarse aún más en monómeros o no. Para abordar esta pregunta, se ha estudiado una variante TmPep1050, TmPep1050H60A H307A,cuyos sitios de unión de metales se ven deteriorados al mutar His-60 (sitio M2) e His-307 (sitio M1) a los residuos de Ala. Este protocolo puede ser acomodado para estudiar otros Aminopeptidases M42 o cualquier metaloenzimas con comportamiento morfeina-como.
El protocolo descrito aquí permite comprender la transición dimer-dodecamer de TmPep1050 a nivel estructural. La metodología fue experimentada anteriormente para determinar la estructura de ambos oligómeros TmPep105011. El paso más difícil fue encontrar condiciones que promuevan la disociación de los dodecamers en dimers estables. Tales condiciones tenían que ser lo suficientemente suaves como para permitir la reasociación de los dimers en los dodecamers cuando se añadió el cofactor de …
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Martine Roovers por revisar este documento y dar comentarios constructivos. El acceso a la línea de haz Próxima 2 (sincrotrón SOLEIL) estaba dentro de los grupos de asignación de bloques 20151139.
1,10-phenanthroline | Sigma-Aldrich | 13, 137-7 | |
Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K | Merck Millipore | UFC503096 | |
Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K | Merck Millipore | UFC903024 | |
Benzonase Nuclease | Merck Millipore | 70664-3 | |
CCP4 | N/A | visit http://www.ccp4.ac.uk/ | |
cOmplete EDTA-free | Roche | 5056489001 | |
Coot | N/A | visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | |
Crystal Screen I | Hampton Research | HR2-110 | |
Crystal Screen II | Hampton Research | HR2-112 | |
DreamTaq Green PCR Master Mix | ThermoFisher Scientific | K1082 | |
EasyXtal 15-well tool | NeXtal | 132007 | |
Escherichia coli PPY strain | N/A | see reference 31 | |
Escherichia coli XL1 blue strain | Agilent | 200249 | |
Gel Filtration Calibration Kit HMW | GE Healthcare Life Sciences | 28-4038-42 | |
Gel Filtration Calibration Kit LMW | GE Healthcare Life Sciences | 28-4038-41 | |
Gel Filtration Standard | Biorad | 1511901 | |
GeneJET Plasmid Miniprep Kit | ThermoFisher Scientific | K0503 | |
Index | Hampton Research | HR2-144 | |
Litholoops | Molecular Dimensions | ||
L-leucine-p-nitroanilide | Bachem AG | 40010720025 | |
Natrix 1 | Hampton Research | HR2-116 | |
Natrix 2 | Hampton Research | HR2-117 | |
Neggia plugin | Dectris | N/A | visit https://www.dectris.com/ |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite I | NeXtal | 130724 | |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite II | NeXtal | 130725 | |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite III | NeXtal | 130726 | |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV | NeXtal | 130727 | |
pBAD-TOPO | ThermoFisher Scientific | K430001 | |
Phenix | N/A | visit https://www.phenix-online.org/ | |
Phusion High-Fidelity DNA polymerase | ThermoFisher Scientific | F-530L | |
Salt RX 1 | Hampton Research | HR2-107 | |
Salt RX 2 | Hampton Research | HR2-109 | |
SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO | ThermoFisher Scientific | 88242 | |
Source 15Phe | GE Healthcare Life Sciences | 17014702 | |
Source 15Q | GE Healthcare Life Sciences | 17094705 | |
Superdex 200 prep grade | GE Healthcare Life Sciences | 17104301 | |
Thermotoga maritima MSB8 strain | American Type Culture Collection | ATCC 43589 | |
TmCD00089984 | DNASU Plasmid Repository | N/A | |
XDS | N/A | visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/ | |
xdsme | N/A | visit https://github.com/legrandp/xdsme |