लाइव हीट में इमेजिंग इंट्रान्यूक्लियर ऐक्टिन रॉड्स ने ड्रोसोफिला भ्रूण पर जोर दिया
Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य हीट तनाव के बाद ड्रोसोफिला भ्रूण और छवि इंट्रान्यूक्लियर ऐक्टिन रॉड असेंबली में रोडामाइन-संयुग्मित गोलाकार ऐक्टिन इंजेक्ट करना है।
Abstract
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य इंट्रान्यूक्लियर ऐक्टिन रॉड की कल्पना करना है जो गर्मी के तनाव के बाद लाइव ड्रोसोफिला मेलनोगास्टर भ्रूण में इकट्ठा होते हैं। ऐक्टिन रॉड एक संरक्षित, अकांक्षित ऐक्टिन स्ट्रेस रिस्पांस (एएसआर) की पहचान है जो न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग सहित मानव विकृतियों के साथ है। पहले, हमने दिखाया कि ASR morphogenesis विफलताओं और भ्रूण के विकास की क्षमता को कम करने के लिए योगदान देता है । यह प्रोटोकॉल एक मॉडल प्रणाली में ऐक्टिन रॉड असेंबली और एएसआर अंतर्निहित तंत्रों के निरंतर अध्ययन की अनुमति देता है जो इमेजिंग, जेनेटिक्स और बायोकेमिस्ट्री के लिए अत्यधिक उत्तरदायी है। भ्रूण एकत्र कर रहे हैं और उन्हें इंजेक्शन के लिए तैयार करने के लिए एक कवरस्लिप पर घुड़सवार। रोडामाइन-कंजूगेटेड गोलाकार ऐक्टिन (जी-ऐक्टिनरेड)को पतला कर माइक्रोनीडल में लोड किया जाता है। प्रत्येक भ्रूण के केंद्र में एक ही इंजेक्शन बनाया जाता है। इंजेक्शन के बाद, भ्रूण को ऊंचा तापमान पर इनक्यूबेटेड किया जाता है और इंट्रान्यूक्लियर ऐक्टिन रॉड को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना की जाती है। फोटोब्लैचिंग (एफआरएपी) प्रयोगों के बाद फ्लोरेसेंस रिकवरी ऐक्टिन छड़ पर की जा सकती है; और साइटोप्लाज्म में अन्य ऐक्टिन-समृद्ध संरचनाओं को भी चित्रित किया जा सकता है। हम पाते हैं कि जी-ऐक्टिनरेड पॉलीमराइज अंतर्जात जी-ऐक्टिन की तरह है और अपने आप में सामान्य भ्रूण विकास में हस्तक्षेप नहीं करता है । इस प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि भ्रूण को गंभीर चोट से बचने के लिए इंजेक्शन के दौरान देखभाल की जानी चाहिए । हालांकि, अभ्यास के साथ, ड्रोसोफिला भ्रूण में जी-ऐक्टिनरेड इंजेक्शन एक तेज और विश्वसनीय तरीका है जो ऐक्टिन छड़ की कल्पना करता है और आसानी से किसी भी जीनोटाइप की मक्खियों के साथ या हाइपोक्सिया और ऑक्सीडेटिव तनाव सहित अन्य सेलुलर तनावों की शुरूआत के साथ उपयोग किया जा सकता है।
Introduction
इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे जी-actinलाल सुई के लिए गर्मी में इंट्रान्यूक्लियर ऐक्टिन छड़ की विधानसभा की कल्पना करने के लिए जोर दिया भ्रूण है कि एक शिक्षादायक ऐक्टिन तनाव प्रतिक्रिया(ASR) 1के दौर से गुजर रहे हैं । हमने एएसआर के अध्ययनों में सहायता करने के लिए यह प्रोटोकॉल विकसित किया है, जो भ्रूण में बाधित मॉर्फोजेनेसिस और कम व्यवहार्यता की ओर जाता है, और वयस्क मानव कोशिका प्रकार गुर्दे की विफलता2,मांसपेशियों के मायोपैथी3,और अल्जाइमर और हंटिंगटन रोग4,5,6,7, 8सहित विकृतियों से जुड़ा हुआ है। यह एएसआर कई सेलुलर तनावों से प्रेरित होता है, जिसमें हीट शॉक9,10,11,ऑक्सीडेटिव स्ट्रेस4,6,कम एटीपी संश्लेषण12,और असामान्य हंटिंगटिन या β-एमिलॉयड ओलिगोमेराइजेशन4,5,6,7,9,13,14,15, 16शामिल हैं। एएसआर की एक बानगी प्रभावित कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म या नाभिक में एबररेंट ऐक्टिन छड़ की असेंबली है, जो एक ऐक्टिन इंटरैक्टिंग प्रोटीन, कोफिलिन 1,5,6,10के तनाव-प्रेरित अतिसक्रियण से प्रेरित है। दुर्भाग्य से, प्रमुख ज्ञान अंतराल एएसआर के बारे में रहते हैं। उदाहरण के लिए, ऐक्टिन रॉड के कार्य की जानकारी नहीं है। हमें समझ में नहीं आता कि छड़ कुछ कोशिका प्रकारों के साइटोप्लाज्म में क्यों बनते हैं, लेकिन दूसरों के नाभिक। और न ही यह स्पष्ट है कि ASR कोशिकाओं या तनाव के दौर से गुजर भ्रूण के लिए सुरक्षात्मक या दुर्अनुके है । अंत में, हम अभी भी विस्तृत तंत्र अंतर्निहित Cofilin अति सक्रियता या actin रॉड विधानसभा पता नहीं है । इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल जीवित फल फ्लाई भ्रूण की अत्यधिक पथीय प्रायोगिक प्रणाली में ऐक्टिन रॉड गठन और गतिशीलता की कल्पना करके एएसआर की जांच करने के लिए एक तेजी से और बहुमुखी परख प्रदान करता है।
जीवित ड्रोसोफिला भ्रूण में जी-ऐक्टिनरेड को माइक्रोजेक्ट करने का प्रोटोकॉल शुरू में ऊतक निर्माण की घटनाओं के दौरान सामान्य साइटोप्लाज्मिक ऐक्टिनसंरचनाओं 17 की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था। उन अध्ययनों में, हमने पाया कि जी-ऐक्टिनलाल इंजेक्शन भ्रूण में प्रारंभिक विकास प्रक्रियाओं को प्रतिकूल रूप से प्रभावित नहीं करता था, जिसमें साइटोकिन्सिस या गैस्ट्रुलेशन17,18शामिल हैं। हम तो प्रोटोकॉल संशोधित, भ्रूण हैंडलिंग और जी actinलाल इंजेक्शन अनुकूल करने के लिए गर्मी में ऐक्टिन छड़ की इमेजिंग की अनुमति के लिएएएसआर 1के दौर से गुजर भ्रूण पर बल दिया । जी-ऐक्टिनरेड इंजेक्शन के अलावा अन्य तरीकों का इस्तेमाल भ्रूण में ऐक्टिन की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है। ये तरीके ऐक्टिन या ऐक्टिन बाइंडिंग प्रोटीन के डोमेन के लिए टैग किए गए फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपीएस) को व्यक्त करने पर भरोसा करते हैं, जैसे यूट्रोफिन-एमएचरी, लाइफएक्ट, एफ-ट्रैक्टिन-जीएफपी, और मोसिन-जीएफपी(19में समीक्षा) । हालांकि, इन एफपी जांच का उपयोग करने के लिए सावधानी की आवश्यकता होती है क्योंकि वे कुछ ऐक्टिन संरचनाओं को स्थिर या बाधित कर सकते हैं, सभी ऐक्टिन संरचनाओं को समान रूप से लेबल नहीं कर सकते हैं20,और ऐक्टिन-जीएफपी के मामले में, अत्यधिक अतिएक्सप्रेस किए गए हैं – रॉड असेंबली के विश्लेषण के लिए समस्याग्रस्त जो न केवल तनाव पर निर्भर है बल्कि एकाग्रता निर्भर भी है1। इस प्रकार, जी-ऐक्टिनरेड फ्लाई भ्रूण में रॉड अध्ययन के लिए पसंदीदा जांच है, और भ्रूण का बड़ा आकार इसके आसान इंजेक्शन की अनुमति देता है।
इस प्रोटोकॉल का कार्यप्रवाह अन्य सुस्थापित माइक्रोइंजेक्शन तकनीकों के समान है जिनकाउपयोग ड्रोसोफिला भ्रूण21, 22, 23,24,25,26,27मेंप्रोटीन,न्यूक्लिकएसिड,ड्रग्स और फ्लोरोसेंट संकेतकों को इंजेक्शन लगाने के लिए किया गया है। हालांकि, यहां जी-ऐक्टिनरेड के माइक्रोइंजेक्शन के बाद भ्रूण को एएसआर और इंट्रान्यूक्लियर ऐक्टिन रॉड असेंबली को प्रेरित करने के लिए हल्के गर्मी के तनाव के संपर्क में आते हैं । मक्खियों और एक इंजेक्शन रिग तक पहुंच वाली प्रयोगशालाओं के लिए, इस विधि को एएसआर के संबंध में अध्ययन की विशिष्ट पंक्तियों के लिए आसानी से लागू करने योग्य और अनुकूलनीय होना चाहिए, जिसमें अलग-अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि में विभिन्न तनावों या मॉड्यूलेशन द्वारा इसका शामिल होना शामिल है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस विधि का महत्व यह है कि यह21, 22, 23, 24, 25,26, 27 में माइक्रोइंजेक्शन के सुस्थापित प्रोटोकॉल का उपयोग करता है ताकि एएसआर और साथ में ऐक्टि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों ने लिउलु झेंग और जेंगहुई Xue के काम को स्वीकार किया, जिन्होंने सोक लैब में इस तकनीक को अग्रणी करने में मदद की, साथ ही हसन सीडे ने विश्लेषण में मदद की। इस अध्ययन के लिए काम NIH (R01 GM115111) से एक अनुदान द्वारा वित्त पोषित है ।
Materials
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore-Sigma | A23835G | Component of G buffer |
| Apple juice, Mott's, 64 fl oz | Mott's | 014800000344 | Component of apple juice plates |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Component of apple juice plates |
| Bleach, PureBright Germicidal, 6.0% sodium hypochlorite | KIK International | 059647210020 | For dechorionating embryos |
| Calcium chloride | Millipore-Sigma | C1016500G | Component of G buffer |
| Cell strainer, 70 μm | Falcon | 352350 | For collecting dechorionated embryos |
| Confocal microscope, LSM 880 34-channel with Airyscan | Zeiss | 0000001994956 | For imaging intranuclear actin rods |
| Desiccant | Drierite | 24001 | For desiccating embryos |
| Dissecting microscope, Stemi 508 Stereoscope with 8:1 zoom | Zeiss | 4350649000000 | For arranging embryos on agar wedge |
| Dissecting needle, 5 in | Fisher Scientific | 08965A | For arranging embryos on agar wedge |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP1725 | Component of G buffer |
| Double-sided Tape, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in | 3M | 021200010323 | For making embryo glue |
| Embryo collection cage | Genessee Scientific | 59100 | For housing adult flies and collecting embryos |
| Fine tip tweezers, Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72701D | For arranging embryos on agar wedge |
| Glass capillaries, Borosillicate glass, thin 1 mm x 0.75 mm | World Precision Instruments, Inc. | TW1004 | For microneedles |
| Halocarbon oil 27 | Millipore-Sigma | H8773100ML | For hydration of embryos |
| Heated stage incubator | Zeiss | 4118579020000, 4118609020000, 4118609010000 | For confocal imaging |
| Lab Tissue Wipers, KimWipes | Kimberly-Clark | 34155 | Lab tissue wipers |
| Light microscope, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscope, refurbished | Zeiss | Discontinued | Injection microscope |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Millipore-Sigma | H36471KG | Component of apple juice plates |
| Microinjector, FemtoJet4x | Eppendorf | 5253000025 | Microinjector |
| Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 μL | Eppendorf | 5242956003 | For loading microneedles |
| Micromanipulator and injection stage with x,y,z dials for needle adjustment | Bernard Instruments, Inc (Houston, TX) | Custom | For performing microinjections |
| Micropipette puller, Model P-97, Flaming/Brown | Sutter Instruments | P97 | For pulling capillary tubes to make microneedles |
| Microscope cover glass 24×50-1.5 | Fisher Scientific | 12544E | For mounting embryos |
| Microscope slides, Lilac Colorfrost, Precleaned, 25 x 75 x 1mm | Fisher Scientific | 22037081 | For mounting embryos for injection |
| n-Heptane | Fisher Scientific | H3601 | Component of embryo glue |
| Objective, 10x | Zeiss | Discontinued | 10x objective for injection microscope |
| Objective, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS | Zeiss | 4217679971711 | 40x water objective for confocal |
| Objective, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 for oil, water, silicone oil or glycerine immersion (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm) | Zeiss | 4208529871000 | 25x mixed immersion objective for confocal |
| Objective, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA | Zeiss | 4207829900799 | 63x oil objective for confocal |
| Paintbrush, Robert Simmons Expression E85 Pointed Round size 2 | Daler-Rowney | 038372016954 | For transferring embryos |
| Paper towels, Kleenex C-fold paper towels, white | Kimberly-Clark | 884266344845 | For blotting cell strainer |
| Pasteur pipette, 5 3/4 in | Fisher Scientific | 1367820A | For covering embryos with oil |
| Petri dish, glass, 100 x 20 mm | Corning | 3160102 | For humid incubation chamber |
| Petri dish, plastic, 60 x 15 mm | VWR | 25384092 | For apple juice plates |
| Pipette, Eppendorf Reference 0.5-10 μL | Eppendorf | 2231000604 | For loading the microneedle |
| Pipette tip, xTIP4 250 μL | Biotix | 63300006 | For adding embryo glue to coverslip |
| Razor blade | VWR | 55411050 | For cutting agar wedge, tape, pipette tips |
| Rhodamine-conjugated globular actin, human platelet (non-muscle; 4×10 μg) | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | G-actin^Red |
| Scintillation vial, 20 mL Glass borosillicate with polyethylene liner and urea caps | Fisher Scientific | 033377 | For making embryo glue |
| Screw top jar, 16 oz | Nalgene | 000194414195 | For desiccating embryos |
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 602104PG | For calibrating volume of G-actin injection |
| Sucrose | Millipore-Sigma | 840971KG | Component of apple juice plates |
| Trizma base | Millipore-Sigma | T15031KG | Component of G buffer |
| Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz | Lesaffre Yeast Corporation | 117929157002 | Component of yeast paste |
References
- Figard, L., et al. Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos. Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).
- Ashworth, S. L., et al. ADF/cofilin mediates actin cytoskeletal alterations in LLC-PK cells during ATP depletion. American Journal of Physiology Renal Physiology. 284 (4), 852-862 (2003).
- Vandebrouck, A., et al. In vitro analysis of rod composition and actin dynamics in inherited myopathies. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (5), 429-441 (2010).
- Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biology. 2 (9), 628-636 (2000).
- Bamburg, J. R., et al. ADF/Cofilin-actin rods in neurodegenerative diseases. Current Alzheimer Research. 7 (3), 241-250 (2010).
- Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in alzheimer disease. Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).
- Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. AJP: Cell Physiology. 291 (5), 828-839 (2006).
- Munsie, L. N., Desmond, C. R., Truant, R. Cofilin nuclear-cytoplasmic shuttling affects cofilin-actin rod formation during stress. Journal of Cell Science. 125 (17), 3977-3988 (2012).
- Iida, K., Iida, H., Yahara, I. Heat shock induction of intranuclear actin rods in cultured mammalian cells. Experimental Cell Research. 165, 207-215 (1986).
- Ohta, Y., Nishida, E., Sakai, H., Miyamoto, E. Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16143-16148 (1989).
- Iida, K., Matsumoto, S., Yahara, I. The KKRKK sequence is involved in heat shock-induced nuclear translocation of the 18-kDa actin-binding protein, cofilin. Cell Structure and Function. 17 (1), 39-46 (1992).
- Minamide, L. S., et al. Isolation and characterization of cytoplasmic cofilin-actin rods. Journal of Biological Chemistry. 285 (8), 5450-5460 (2010).
- Masurovsky, E. B., Benitez, H. H., Kim, S. U., Murray, M. R. Origin, development, and nature of intranuclear rodlets and associated bodies in chicken sympathetic neurons. The Journal of Cell Biology. 44 (7), 172-191 (1970).
- Feldman, M. L., Peters, A. Intranuclear rods and sheets in rat cochlear nucleus. Journal of Neurocytology. 1 (2), 109-127 (1972).
- Nishida, E., et al. Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells. Cell Biology. 84 (8), 5262-5266 (1987).
- Ono, S., Abe, H., Nagaoka, R., Obinata, T. Colocalization of ADF and cofilin in intranuclear actin rods of cultured muscle cells. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (2), 195-204 (1993).
- Xue, Z., Sokac, A. M. Back-to-back mechanisms drive actomyosin ring closure during Drosophila embryo cleavage. The Journal of Cell Biology. 215 (3), 335-344 (2016).
- Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. Nuf, a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization. Journal of Cell Biology. 182 (2), 301-313 (2008).
- Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 393 (2), 209-226 (2014).
- Chen, Q., Nag, S., Pollard, T. D. Formins filter modified actin subunits during processive elongation. Journal of Structural Biology. 177 (1), 32-39 (2012).
- Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (50), 2477 (2011).
- Juarez, M. T., Patterson, R. A., Li, W., McGinnis, W. Microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 81, 50750 (2013).
- Carreira-Rosario, A., et al. Recombineering homologous recombination constructs in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (77), 50346 (2013).
- Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Microinjection techniques for studying mitosis in the Drosophila melanogaster syncytial embryo. Journal of Visualized Experiments. (31), 1382 (2009).
- Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. Visualizing and tracking endogenous mRNAs in live Drosophila melanogaster egg chambers. Journal of Visualized Experiments. (148), 58545 (2019).
- Wessel, A. D., Gumalla, M., Grosshans, J., Schmidt, C. F. The mechanical properties of early Drosophila embryos measured by high-speed video microrheology. Biophysical Journal. 108 (8), 1899-1907 (2015).
- Mollinari, C., González, A., Cid-Arregui, A., García-Carrancá, Microinjection and transgenesis. Microinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols. , 587-603 (1998).
- Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (49), 2503 (2011).
- Oesterle, A. . Pipette Cookbook 2018: P-97 and P-1000 Micropipette Pullers. , (2018).
- Bownes, M. A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 33 (3), 789-801 (1975).
- Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8 (4), 474-520 (1935).
- Hunter, M. V., Willoughby, P. M., Bruce, A. E. E., Fernandez-Gonzalez, R. Oxidative Stress Orchestrates Cell Polarity to Promote Embryonic Wound Healing. Developmental Cell. 47 (3), 377-387 (2018).
