غشاء الخلية الأصلية نظام الجسيمات النانوية لتحليل التفاعل البروتينية الغشاء
Summary
هنا هو بروتوكول لتحديد الدولة القلة من البروتينات الغشاء الذي يستخدم نظام غشاء الخلايا الأصلية نانو جسيمات بالاقتران مع المجهر الإلكتروني.
Abstract
التفاعلات البروتينية البروتينية في أنظمة غشاء الخلية تلعب أدواراً حاسمة في مجموعة واسعة من العمليات البيولوجية – من التفاعلات بين الخلايا إلى الخلية إلى تحويل الإشارة؛ من استشعار الإشارات البيئية إلى الاستجابة البيولوجية؛ من تنظيم التمثيل الغذائي إلى التحكم في النمو. إن المعلومات الهيكلية الدقيقة للتفاعلات البروتينية البروتينية أمر حاسم لفهم الآليات الجزيئية لمجمعات البروتينات الغشائية وتصميم جزيئات محددة للغاية لتعديل هذه البروتينات. وقد تم تطوير العديد من في الحي وفي المختبر النهج للكشف عن وتحليل التفاعلات البروتين البروتين. ومن بينها نهج البيولوجيا الهيكلية هي فريدة من نوعها من حيث أنه يمكن أن توفر معلومات هيكلية مباشرة من البروتين البروتين التفاعلات على المستوى الذري. ومع ذلك، لا يزال الغشاء الحالي البيولوجيا الهيكلية البروتين تقتصر إلى حد كبير على الأساليب القائمة على المنظفات. العيب الرئيسي للطرق القائمة على المنظفات هو أنها غالبا ما تتفكك أو تجزئة مجمعات البروتين غشاء مرة واحدة يتم إزالة البيئة ثنائية الطبقة الدهون الأصلية من قبل جزيئات المنظفات. لقد تم تطوير نظام جسيمات نانوية غشاء الخلية المحلية للغشاء البيولوجيا الهيكلية البروتين. هنا، ونحن نثبت استخدام هذا النظام في تحليل التفاعلات البروتين البروتين على غشاء الخلية مع دراسة حالة من الدولة القلة من AcrB.
Introduction
تلعب التفاعلات البروتينية (PPI) أدوارًا محورية في جميع أنحاء علم الأحياء ، من الحفاظ على بنية ووظيفة البروتينات إلى تنظيم الأنظمة بأكملها. تأتي مؤشرات أسعار المنتجين في أشكال مختلفة ويمكن تصنيفها استنادًا إلى أنواع التفاعلات التي تشكلها. أحد هذه التصنيفات هو هو homooligomeric أو هيترووليجومي، على أساس ما إذا كانت التفاعلات بين الوحدات الفرعية متطابقة أو بروتينات مختلفة تعمل كمكونات فرعية. ويستند تصنيف آخر على قوة التفاعل إذا كانت التفاعلات تؤدي إلى تشكيل مجمعات مستقرة أو حالات معقدة عابرة. المعلومات الهيكلية حول PPIs بين البروتينات أمر بالغ الأهمية في فهم الآلية التي البروتينات تنفيذ وظيفتها. وقد قدر أن أكثر من 80٪ من البروتينات تعتمد على تشكيل معقد من أجل القيام بأدوارهم الوظيفية1. وبالنظر إلى النسبة المئوية للبروتينات التي لوحظت أنها تعتمد على مؤشرات أسعار المنتجين من أجل الأداء الفطري السليم، فإن أهميتها في علم الأحياء واضحة بسهولة، ومع ذلك فإن القدرة على التحقيق بشكل صحيح في البروتينات التي تشارك في هذه التفاعلات ظلت صعبة بسبب القيود في التقنيات المتاحة لمراقبة تجريبية عندما تشكل البروتينات مؤشرات أسعار المنتجين.
هناك درجة عالية من الاختلاف بين النتائج للعديد من PPIs محددة تجريبيا بسبب كمية عالية من الضوضاء ، والإيجابيات الكاذبة ، والسلبيات الكاذبة التي هي مستمدة من العديد من التقنيات المتاحة حاليا تحديد مؤشر أسعار المنتجين. هذا هو الحال بشكل خاص بالنسبة للخميرة اثنين الهجين (Y2H) النظام ، جنبا إلى جنب تقارب تنقية الطيف الكتلي (TAP – MS) ، ونقل الطاقة الرنين الفلوري (فريت) ، والتي تمثل ثلاثة من الأساليب الأكثر استخداما لتحديد PPI2،3،4،5،6،7. وبالمقارنة، يمكن استخدام تقنيات البيولوجيا البنيوية للبروتين، مثل الرنين المغناطيسي النووي (NMR) والتصوير البلوري بالأشعة السينية والمجهر الإلكتروني (EM)، للحصول على معلومات هيكلية عالية الدقة حول تفاعلات البروتين والبروتين وصولاً إلى المستوى الذري والسماح بالتأكد البصري المباشر من التفاعلات التي تحدث لبروتين ذي فائدة مستهدفة. جميع المتاحة حاليا غير هيكل أساس PPI تحديد تقنيات البحث (على سبيل المثال، Y2H، TAP-MS، وFRET) تفتقر إلى هذه القدرة، ويعانون بالإضافة إلى ذلك من صعوبة في تحديد التفاعلات الضعيفة والعابرة بين البروتينات5. وتتعزز هذه النقائص عند دراسة البروتينات الغشاء بسبب التعقيد الإضافي الناجم عن المتغير الإضافي للبيئة الدهنية التي تؤثر على تشكيل الهيكل الرباعي السليم والتجميع المعقد غير الستيري.
تشكل بروتينات الأغشية جزءًا كبيرًا من البروتيوم ومن المعروف أنها تلعب العديد من الأدوار الحاسمة في عمل الخلايا السليمة داخل جميع الكائنات الحية. على الرغم من أن البروتينات الغشاء تقدر لتشكل 27٪ من الجينوم البشري وتشكل ~ 60٪ من جميع أهداف المخدرات الحالية هناك شذوذ كبير في عدد النماذج حلها للبروتينات الغشاء التي تشكل فقط ~ 2.2٪ من جميع الهياكل البروتينية المنشورة8،9،10. السبب الرئيسي للتباين في توافر المعلومات الهيكلية يكمن في الخصائص الجوهرية للبروتينات الغشاء أنفسهم. بسبب ضعف الذوبان، والاعتماد على التفاعلات مع بيئة الدهون للحفاظ على بنية ووظيفة الأم، والخصائص الفيزيائية الكيميائية المختلفة للغشاء الدهني نفسه، لا تزال البروتينات الغشاء يمثل مشكلة كبيرة عند تنفيذ تقنيات البيولوجيا الهيكلية لدراستها. من هذه الخصائص الجوهرية، أهم للحصول على معلومات هيكلية دقيقة هو شرط وجود تفاعلات مع البيئة الطبيعية للدهون بالنسبة لهم للحفاظ على هيكلها الأصلي ووظيفتها. البيئة الدهنية مثل هذا جزء لا يتجزأ من هيكل ووظيفة البروتينات الغشاء أن مفهوم memtein (مزيج من الكلمات غشاء والبروتين) وقد اقترح كوحدة أساسية من هيكل غشاء البروتين وظيفة11. على الرغم من أهمية التفاعلات البروتين الدهني المتوفرة حاليا على أساس هيكل PPI تقنيات تحديد غالبا ما تتطلب أن البروتينات التي يجري دراستها تكون قابلة للذوبان أو أن solubilized مع المنظفات. التعرض للمنظفات القاسية يمكن أن تشوه البروتينات أو تسبب ايجابيات وسلبيات كاذبة بسبب إزالة الليببيديشن، والتي يمكن أن تحفز التجميع، denaturation البروتين، تفكك التفاعلات غير التكافؤ، وتشكيل الدول القلوية الاصطناعية. نظرا لضرورة الحفاظ على بيئة الدهون الطبيعية لتحديد دقيق للدولة oligomeric الأصلي من البروتينات الغشاء وضعنا نظام جسيمات نانوية غشاء الخلايا الأصلية (NCMNs)12 استنادا إلى ذكر سابقا الستيرين حمض الجزيئات الدهنية (SMALP)13 طريقة.
SMALP يستخدم الستيرين حمض البيلومير حمض المالويك كما البوليمر غشاء نشط لاستخراج و solubilize البروتينات الغشاء. Poly(Styrene-co-Maleic Acid) (SMA) هو بوليمر أمفيفيلي فريد بسبب مويت الستيرين الماعور ويعارض تماماً حمض ماليك هيدروفيلي. وهو يشكل الجسيمات النانوية عن طريق التمصاص ، وزعزعة الاستقرار ، وتعطيل غشاء الخلية في آلية تعتمد على الأسى والh14. هذا النشاط الوظيفي من SMA هو ما يسمح لها أن تستخدم كنظام خال من المنظفات لاستخراج البروتين غشاء و solubilization. يتميز نظام NCMN عن نظام SMALP في عدة جوانب. الميزة الأكثر فريدة من نوعها من نظام NCMN هو أن لديها مكتبة البوليمر غشاء نشط مع العديد من البوليمرات التي لها خصائص فريدة من نوعها التي تجعلها مناسبة لعزل العديد من البروتينات الغشاء المختلفة التي تتطلب ظروف مختلفة للاستقرار والأداء الأصلي. كما أن نظام NCMN لديه بروتوكولات مختلفة مقارنة بطريقة SMALP عندما يتعلق الأمر بإعداد الجسيمات النانوية. ومن الأمثلة على ذلك أن الناصحات الوطنية للنقان تستخدم تنقية عمود تقارب النيكل أحادي الخطي لتحديد الهيكل عالي الدقة؛ ويمكن ملاحظة تأثير هذه البروتوكولات المختلفة عند مقارنة بروتوكول NCMNs ، الذي ولدت 3.2 و 3.0 Å Å كريو – م AcrB الهياكل ، مع دراسة مماثلة باستخدام طريقة SMALP ، مما أدى إلى هيكل 12 15 Åالقرار. هذه السمات الفريدة لنظام NCMN هي التحسينات التي أدخلت على طريقة SMALP التي تم إنشاؤها سابقاً وتجعلها مرشحًا مثاليًا لدراسة مؤشرات أسعار المنتجين.
و متعدد المخدرات efflux الناقل AcrB موجود كما homotrimer وظيفية في E. القولونية12. واقترح تحليل مطفرة أن طفرة نقطة P223G واحدة، وتقع على حلقة التي هي المسؤولة عن استقرار تريم AcrB، يزعزع استقرار حالة الثلث ويسفر عن مونومر AcrB عند إعدادها مع المنظفات DDM، والتي يمكن الكشف عنها مع الجيل الأزرق الأصلي الكهربائي16. ومع ذلك ، فإن تحليل FRET من AcrB – P223G متحولة اقترح أنه عندما في الخلية الأصلية غشاء الدهون bilayer البيئة ، وغالبية متحولة AcrB – P223G لا تزال موجودة كما تريم وأن مستويات التعبير عن كل من نوع البرية AcrB و AcrB – P223G متشابهة. ومع ذلك، وعلى الرغم من نتائج تحليل فريت، أظهرت مقايسة نشاط النقل متحولة أن النشاط انخفض بشكل كبير بالمقارنة مع نوع البرية16. على الرغم من أن تكنولوجيا فريت قد استخدمت شعبيا لتحليل البروتين البروتين التفاعلات, وقد أظهرت الأبحاث أنه يمكن أن تعطي في كثير من الأحيان ايجابيات كاذبة17,18,19,20.
في الآونة الأخيرة، تم تحديد عالية الدقة هياكل cryo-EM من تريمر AcrB الذي أظهر التفاعل مع AcrB مع غشاء الخلية الأصلية المرتبطة بها bilayer الدهون من خلال استخدام NCMNs12. من حيث المبدأ، يمكن بسهولة استخدام الـ NCMNs لتحليل تفاعلات البروتين والبروتين الموجودة على غشاء الخلية الأصلية. في اختبار لهذا النظام، أجريت تجارب لمراقبة حالة القلة في AcrB-P223G مباشرة باستخدام الجسيمات النانوية لغشاء الخلايا الأصلية والمجهر الإلكتروني السلبي الملطخ. من أجل مقارنة مع نوع البرية AcrB الجسيمات النانوية، استخدمنا نفس البوليمر النشط غشاء (SMA2000 المحرز في مختبرنا، والتي يتم فهرستها كما NCMNP1-1 في مكتبة NCMN) تستخدم لتحديد هيكل عالي الدقة كريو EM من AcrB والبوليمرات البديلة الموجودة في مكتبة NCMNs12. استنادا إلى النتائج التي تم الإبلاغ عنها سابقا، كان من المتوقع أن غالبية متحولة AcrB-P223G موجودة في شكل جسيمات نانوية غشاء الخلايا الأصلية ثلاثية الكرسية21. ومع ذلك، لم يتم العثور على أي تقليم AcrB موجودة في العينة، مثل تلك التي لوحظت مع نوع البرية AcrB. وهذا يشير إلى أن غالبية AcrB-P223G لا تشكل تقليم على غشاء الخلية الأصلية كما اقترح سابقا.
هنا نبلغ عن تحليل مفصل لـ E. coli AcrB-P223G في مقارنة مع النوع البري E. القولونية AcrB باستخدام NCMNs. هذه الدراسة الحالة من AcrB تشير إلى أن الـ NCMNs هو نظام جيد لتحليل التفاعل بين البروتين والبروتين.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتين البروتين التفاعلات مهمة لسلامة هيكل ووظيفة البروتينات الغشاء. وقد تم تطوير العديد من النهج لدراسة التفاعلات البروتينية البروتينية. عند مقارنتها مع البروتينات القابلة للذوبان، البروتينات الغشائية و PPIs الخاصة بهم هي أكثر صعوبة في الدراسة بسبب الخصائص الجوهرية الفريدة للبروتينا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا البحث من قبل صندوق بدء العمل VCU (إلى Y.G.) والمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة في المعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة R01GM132329 (إلى Y.G.) والمحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحده ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. ونشكر مونتسيرات سامسو وكيفن ماك روبرتس على دعمهما السخي لتسجيل الفيديو.
Materials
| Chemicals | |||
| 30% Acrylamide/BIS SOL (37.5:1) | Bio-Rad | 161-0158 | |
| 4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Acetic Acid Glacial | ThermoFisher Scientific | A38S-212 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Chloramphenicol | Goldbio | C-105-5 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 protein stain powder | Bio-Rad | 161-0400 | |
| DTT (Dithiothreitol) (> 99% pure) Protease free | Goldbio | DTT10 | |
| Glycerol | ThermoFisher Scientific | G33-4 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | BP310-1 | |
| Imidazole | Affymetrix | 17525 1 KG | |
| IPTG | Goldbio | I2481C100 | |
| Kanamycin | Goldbio | K-120-25 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | ThermoFisher Scientific | AA3622636 | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | A412-4 | |
| N,N-dimethylethylenediamine (EDTA) | Merck | 8.03779.0100 | |
| NCMNS-P5-2 | Not commercially available yet | Submit request for obtaining to corresponding author | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Bio-Rad | 161-0301 | |
| SMA2000 | Cray Valley | Submit request for obtaining to corresponding author | |
| Sodium Chloride | ThermoFisher Scientific | S271-10 | |
| TCEP-HCl | Goldbio | TCEP25 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Terrific Broth Media | Affymetrix | 75856 1 KG | |
| Tris Base | Bio-Rad | 161-0719 | |
| Uranyl Acetate | Ambinter | Amb22348393 | |
| Equipment | |||
| Avanti J-26S XPI | Beckman Coulter | B14538 | |
| Avanti JXN-30 | Beckman Coulter | B34193 | |
| Carbon Electron Microscope Grids (10 nm) | Electron Microscopy Sciences | CF300-Cu-TH | |
| Con-Torque Tissue Homogenizer | Eberbach | E7265 | |
| Corning LSE Mini Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 07-203-954 | |
| EmulsiFlex-C3 | Avestin | ||
| Fraction Collector F9-R | GE Healthcare Life Sciences | 29003875 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-8004 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
| PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S-230 | |
| Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue Grinder | Wheaton | 358013 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 164-5050 | |
| Razel R99-E Variable Speed Syringe Pump | Razel Scientific Instruments | ||
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 28990944 | |
| Tecnai F20 200kV | FEI | ||
| Type 70 Ti Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | ||
| General Materials | |||
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 05-408-129 | |
| 4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa | Millipore Sigma | UFC803024 | |
| AKTA pure 25 L1 FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 29018225 | |
| BL21(DE3)pLysS Cells | ThermoFisher Scientific | C606003 | |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | |
| HisTrap HP 5 ml Column | GE Healthcare Life Sciences | 17524802 | |
| pET-24a | EMD Biosciences | 69749-3 |
References
- Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
- Huang, H., Bader, J. S. Precision and recall estimates for two-hybrid screens. Bioinformatics. 25 (3), 372-378 (2009).
- Serebriiskii, I. G., Golemis, E. A. Two-hybrid system and false positives. Approaches to detection and elimination. Methods in Molecular Biology. 177, 123-134 (2001).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (8), 645-654 (2007).
- Ngounou Wetie, A. G., et al. Investigation of stable and transient protein-protein interactions: Past, present, and future. Proteomics. 13 (3-4), 538-557 (2013).
- Schaufele, F. Maximizing the quantitative accuracy and reproducibility of Forster resonance energy transfer measurement for screening by high throughput widefield microscopy. Methods. 66 (2), 188-199 (2014).
- Berney, C., Danuser, G. FRET or no FRET: a quantitative comparison. Biophysical Journal. 84 (6), 3992-4010 (2003).
- Almen, M. S., Nordstrom, K. J., Fredriksson, R., Schioth, H. B. Mapping the human membrane proteome: a majority of the human membrane proteins can be classified according to function and evolutionary origin. BMC Biology. 7, 50 (2009).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there. Nature Reviews in Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
- Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
- Overduin, M., Esmaili, M. Memtein: The fundamental unit of membrane-protein structure and function. Chemistry and Physics of Lipids. 218, 73-84 (2019).
- Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 115 (51), 12985-12990 (2018).
- Knowles, T. J., et al. Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticles bounded by styrene maleic acid copolymer. Journal of the American Chemical Society. 131 (22), 7484-7485 (2009).
- Xue, M., Cheng, L., Faustino, I., Guo, W., Marrink, S. J. Molecular Mechanism of Lipid Nanodisk Formation by Styrene-Maleic Acid Copolymers. Biophysical Journal. 115 (3), 494-502 (2018).
- Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica and Biophysica Acta Biomembrames. 1860 (2), 378-383 (2018).
- Yu, L., Lu, W., Wei, Y. AcrB trimer stability and efflux activity, insight from mutagenesis studies. PLoS One. 6 (12), 28390 (2011).
- Broussard, J. A., Rappaz, B., Webb, D. J., Brown, C. M. Fluorescence resonance energy transfer microscopy as demonstrated by measuring the activation of the serine/threonine kinase Akt. Nature Protocols. 8 (2), 265-281 (2013).
- Ma, L., Yang, F., Zheng, J. Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies. Journal of Molecular Structure. 1077, 87-100 (2014).
- Sachl, R., Humpolickova, J., Stefl, M., Johansson, L. B., Hof, M. Limitations of electronic energy transfer in the determination of lipid nanodomain sizes. Biophysical Journal. 101 (11), 60-62 (2011).
- Woehler, A., Wlodarczyk, J., Neher, E. Signal/noise analysis of FRET-based sensors. Biophysical Journal. 99 (7), 2344-2354 (2010).
- Wang, Z., et al. Comparison of in vitro and in vivo oligomeric states of a wild type and mutant trimeric inner membrane multidrug transporter. Biochemical and Biophysical Reports. 16, 122-129 (2018).
- Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199 (2018).
- Lu, W., Zhong, M., Wei, Y. Folding of AcrB Subunit Precedes Trimerization. Journal of Molecular Biology. 411 (1), 264-274 (2011).
- Lebon, G. . Structure and Function of GPCRs. , 229-230 (2019).
- Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).
- Lee, S. C., et al. A method for detergent-free isolation of membrane proteins in their local lipid environment. Nature Protocols. 11 (7), 1149-1162 (2016).
- Hall, S. C. L., et al. An acid-compatible co-polymer for the solubilization of membranes and proteins into lipid bilayer-containing nanoparticles. Nanoscale. 10 (22), 10609-10619 (2018).
- Oluwole, A. O., et al. Solubilization of Membrane Proteins into Functional Lipid-Bilayer Nanodiscs Using a Diisobutylene/Maleic Acid Copolymer. Angewandte Chemie International Edition England. 56 (7), 1919-1924 (2017).
