Modellering af primære knogletumorer og knoglemetastase med implantation af fast tumortransplantat i knogle

Summary

Knoglemetastasemodeller udvikler ikke metastase ensartet eller med en 100% forekomst. Direkte intra-osseøs tumorcelleinjektion kan resultere i embolisering af lungen. Vi præsenterer vores teknikmodellering af primære knogletumorer og knoglemetastaser ved hjælp af solid tumortransplantatimplantation i knoglen, hvilket fører til reproducerbar engraftment og vækst.

Abstract

Primære knogletumorer eller knoglemetastaser fra solide tumorer resulterer i smertefulde osteolytiske, osteoblastiske eller blandede osteolytiske / osteoblastiske læsioner. Disse læsioner kompromitterer knoglestrukturen, øger risikoen for patologiske brud og efterlader patienter med begrænsede behandlingsmuligheder. Primære knogletumorer metastaserer til fjerne organer, hvor nogle typer er i stand til at sprede sig til andre skeletsteder. Nylige beviser tyder imidlertid på, at kræftceller, der har spredt sig til knogle, med mange solide tumorer kan være den primære kilde til celler, der i sidste ende metastaserer til andre organsystemer. De fleste syngeneiske eller xenograft musemodeller af primære knogletumorer involverer intra-osseøs (ortotopisk) injektion af tumorcellesuspensioner. Nogle dyremodeller af skeletmetastase fra faste tumorer afhænger også af direkte knogleinjektion, mens andre forsøger at rekapitulere yderligere trin i knoglemetastatisk kaskade ved at injicere celler intravaskulært eller ind i organet af den primære tumor. Imidlertid udvikler ingen af disse modeller knoglemetastaser pålideligt eller med en forekomst på 100%. Derudover har direkte intraosseøs injektion af tumorceller vist sig at være forbundet med potentiel tumorembolisering af lungen. Disse emboliske tumorceller indpoder, men rekapitulerer ikke den metastatiske kaskade. Vi rapporterede en musemodel af osteosarkom, hvor friske eller kryopræserverede tumorfragmenter (bestående af tumorceller plus stroma) implanteres direkte i den proksimale skinneben ved hjælp af en minimalt invasiv kirurgisk teknik. Disse dyr udviklede reproducerbar engraftment, vækst og over tid osteolyse og lungemetastase. Denne teknik har den alsidighed, der skal bruges til at modellere solid tumorknoglemetastase og kan let anvende transplantater bestående af en eller flere celletyper, genetisk modificerede celler, patientafledte xenotransplantater og / eller mærkede celler, der kan spores ved optisk eller avanceret billeddannelse. Her demonstrerer vi denne teknik, modellering af primære knogletumorer og knoglemetastase ved hjælp af solid tumortransplantatimplantation i knogle.

Introduction

Musemodeller af sygdomme hos mennesker og dyr bliver stadig mere populære inden for biomedicinsk forskning. Nytten af at bruge mus i denne sammenhæng er, at deres anatomi og fysiologi ligner mennesker meget. De har en relativt kort drægtighedsperiode og tid i postnatal liv for at opnå modenhed og er stort set forbundet med relativt lave omkostninger og lette boliger, omend stigende omkostninger til udvikling eller køb er forbundet med større grader af genetisk modifikation, immundefekt og / eller humanisering¹. Anvendelse af indavlede stammer resulterer i en stort set ensartet dyrepopulation før inklusion i undersøgelsen. Et fuldstændigt kendskab til deres genom tyder på en høj grad af lighed med mennesker. Ortologe molekylære mål for mange sygdomsprocesser er blevet identificeret i musegenomet, og der er nu et omfattende bibliotek af musespecifikke reagenser, der er let tilgængelige. Derfor giver de mulighed for analyse med relativt høj kapacitet på en hurtigere og billigere måde sammenlignet med større dyremodeller¹. Med fremkomsten af genetiske redigeringsstrategier, der giver mulighed for overekspression eller deletion af visse gener enten globalt eller på en celletypespecifik måde og/eller konstitutivt eller på en inducerbar måde, repræsenterer de desuden et meget biologisk nyttigt modelsystem til undersøgelse af sygdomme hos mennesker og dyr².

Kræft er et felt, hvor musemodeller har stor nytteværdi. Genetiske musemodeller af kræft er afhængige af modulering af ekspressionen af enten onkogener eller tumorsuppressorgener, alene eller i kombination, for celler at gennemgå onkogen transformation. Injektionen af primære eller etablerede tumorcellelinjer i mus udføres også. Indførelsen af enten cellelinjer eller væv fra mennesker eller andre dyrearter, herunder mus, er fortsat den mest udbredte kræftmodel in vivo. Anvendelse af celler og væv fra forskellige arter (xenotransplantater) i immunkompromitterede mus udføres oftest². Imidlertid muliggør brugen af allograft tumorceller eller væv, hvor både vært og recipient er af samme art, interaktion med et intakt immunsystem, når det kombineres med den samme værtsmusestamme i syngeneiske systemer³.

Primære knogletumorer eller knoglemetastaser fra solide tumorer resulterer i smertefulde osteolytiske, osteoblastiske eller blandede osteolytiske/osteoblastiske læsioner ^3,4. Disse tumorer kompromitterer knoglestrukturen, øger risikoen for patologisk brud og efterlader patienter med begrænsede behandlingsmuligheder. Primære knogletumorer metastaserer til fjerne organer, hvor nogle typer er i stand til at sprede sig til andre skeletsteder. Hos brystkræftpatienter er knogle det mest almindelige sted for første metastase og det hyppigste første sted for præsentation af metastatisk sygdom ^5,6. Derudover er disseminerede tumorceller (DTC’er) til stede i knoglemarven forud for diagnosen af og forudsiger udviklingen af metastaser i andre organer⁷. Derfor menes det, at kræftceller, der er til stede i knogler, er kilden til celler, der i sidste ende metastaserer til andre organsystemer. Der findes mange musemodeller af solid tumormetastase, der overvejende udvikler metastaser i lunger og lymfeknuder, og afhængigt af tumortype og injektionsteknik, potentielt andre organsystemer³. Imidlertid mangler musemodeller af knoglemetastase, der pålideligt producerer stedspecifik skeletmetastase og udvikler knoglemetastase, før mus når tidlige fjernelseskriterier fra primær tumorbyrde eller metastase til andre organer. Vi har rapporteret en model af den primære knogletumor osteosarkom, der er afhængig af kirurgisk implantation af en solid tumorallograft i den proksimale skinneben hos mus⁸. Knogletumorer dannet hos 100% af mus og 88% udviklede lungemetastase. Denne forekomst af metastase overstiger det, der almindeligvis rapporteres klinisk hos mennesker (~ 20-50%), men er af stor interesse, da lungen er det mest almindelige sted for metastase for osteosarkom 9,10,11. Mens denne model er fordelagtig i modellering primære knogletumorer, har den også stor nytte i modellering af knoglemetastaser fra andre osteotrope faste tumorer såsom bryst, lunge, prostata, skjoldbruskkirtel, lever, nyre og gastrointestinale tumorer.

Begrundelsen for udviklingen af denne model var at udvikle et alternativ til den traditionelle intraosseøse injektion, typisk i den proksimale skinneben eller distale lårben, til at modellere primære knogletumorer eller knoglemetastaser¹². Vores primære mål var at afhjælpe en kendt begrænsning af denne teknik, dvs. tumorembolisering af lungen. Dette resulterer i indkapsling af disse emboliske tumorceller og “kunstig metastase”, der ikke rekapitulerer den komplette metastatiske kaskade fra en etableret primær knogletumor, der metastaserer til lungerne ^8,13. Dette ville også være situationen, når en etableret knoglemetastase spredes til et fjernt sted. Derudover blev denne teknik også udviklet til at producere en model af knoglemetastase, der ville sikre en større forekomst af engraftment og vækst af tumorer i knogler og på et ensartet sted sammenlignet med ortopiske eller intravaskulære injektionsteknikker. Denne model har forskellige fordele i forhold til disse beskrevne teknikker. Denne model indebærer kontrolleret, konsekvent levering af tumorceller ind i knoglen. Det undgår også kunstig lungemetastase efter lungeembolisering og etablerer en baseline ensartet undersøgelsespopulation. Der er fordelen ved stedspecifikke tumorer med denne model uden risiko for tidlige fjernelseskriterier som følge af primære tumorer eller metastaser til andre organer. Endelig har denne model stor anvendelighed til modifikation, herunder brugen af patientafledte xenotransplantater.

Den præsenterede model har ligheder med direkte cellesuspensionsinjektion i knoglen efter en kirurgisk tilgang efterfulgt af enten injektion gennem cortex eller levering i marvhulen efter at have lavet en lille defekt i cortex (med eller uden at udrulle medullært hulrum)8,14,15,16,17. Imidlertid gør implantationen af en tumorallograft denne teknik tydeligt anderledes. Derfor var formålet med denne rapport at demonstrere denne model af primære knogletumorer og knoglemetastaser fra solide tumorer, som overvinder mange begrænsninger af tidligere beskrevne modeller. Forskningsgrupper med erfaring inden for cellekultur, musemodeller, musebedøvelse og kirurgi samt museanatomi er godt rustet til at reproducere vores teknik til at modellere primære knogletumorer eller knoglemetastaser hos mus.

Protocol

Alle beskrevne dyreforsøg blev godkendt af den institutionelle dyrepleje- og brugskomité ved University of Cambridge, Cambridge, Storbritannien. 1. Forberedelse af cellelinjer Dyrk cellelinjer i overensstemmelse med laboratoriets standardcellekulturprotokoller for traditionel cellekultur eller injektion i mus. Standardprotokoller, der anvendes her, er vækst i Dulbeccos modificerede Eagle’s medium indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), L-glutamin og penicillin / streptomycin …

Representative Results

Et positivt resultat ville være forbundet med tumor engraftment og progressiv tumorvækst over tid. Afhængigt af tumortypen kan intraosseøs tumorvækst være forbundet med progressiv halthed i bagbenene, men mange tumorer forårsager ikke halthed på trods af tegn på ledsagende knoglesygdom. Vellykket engraftment blev dokumenteret med avanceret billeddannelse, hvorved der ville være progressive radiografiske, μCT- eller μMRI-ændringer i det proksimale skinneben forbundet med knoglefænotypen af cellelinjen af int…

Discussion

Denne rapport dokumenterer vores model til at skabe primære knogletumorer eller knoglemetastaser efter intratibiel implantation af en tumorallograft. Vi mener, at der er flere kritiske skridt i denne proces. Der bør etableres et sikkert bedøvelsesplan for både subkutan injektion af tumorcellesuspensionen og intratibiel placering af de resulterende tumorfragmenter. Der bør være steril forberedelse af det kirurgiske sted til både fjernelse af det subkutane allotransplantat og intratibiel placering af allotransplanta…

Materials

#15 scalpel blade	Henry Schein Ltd.	75614	None
6-well tissue culture plates	Thermo Fisher Scientific	10578911	Used for mincing tumor pieces. Can also be used for cell culture
Abrams osteosarcoma cell line	Not applicable	Not applicable	None
Anesthesia machine with isoflurane vaporiser and oxygen tank(s)	VetEquip	901805	None
Animal weighing scale	Kent Scientific	SCL- 1015	None
BALB/c nude mouse (nu/nu)	Charles River Ltd.	NA	6-8 weeks of age. Male or female mice
Bone cement	Depuy Synthes	160504	Optional use instead of bone wax
Bone wax	Ethicon	W31G	Optional
Buprenorphine	Animalcare Ltd.	N/A	Buprecare 0.3 mg/ml Solution for Injection for Dogs and Cats
Carbon dioxide euthanasia station	N/A	N/A	Should be provided within animal facility
Cell culture incubator set at 37 °C and 5% carbon dioxide	Heraeus	Various	None
Chlorhexidine surgical scrub	Vetoquinol	411412	None
Cryovials (2 ml)	Thermo Scientific Nalgene	5000-0020	Optional if cryopreserving tumor fragments
D-luciferin (Firefly), potassium salt	Perkin Elmer	122799	Optional if cell line of interest has a bioluminescent reporter gene
Digital caliper	Mitutoyo	500-181-30	Can be manual
Digital microradiography cabinet	Faxitron Bioptics, LLC	MX-20	Optional to evaluate bone response to tumor growth
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	1371171000	Optional if cryopreserving tumor fragments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	None
Ethanol (70%)	Sigma Aldrich	2483	None
Fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	26140079	None
Forceps, Dumont	Fine Science Tools, Inc.	11200-33	None
Freezer (– 80 °C)	Sanyo	MDF-794C	Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments
Hemocytometer	Thermo Fisher Scientific	11704939	Can also use automated cell counter, if available
Hypodermic needles (27 gauge)	Henry Schein Ltd.	DIS55510	May also use 25G (DIS55509) and 30G (Catalog DIS599) needles
Ice	N/A	N/A	Ideally small pieces in a container for syringe and cell suspension storage
Iris scissors	Fine Science Tools, Inc.	14084-08	None
Isoflurane	Henry Schein Ltd.	1182098	None
IVIS Lumina III bioluminescence/fluorescence imaging system	Perkin Elmer	CLS136334	Optional if cell line of interest has bioluminescent or fluorescent reporter genes
L-glutamine	Thermofisher scientifc	25030081	None
Liquid nitrogen	British Oxygen Corporation	NA	Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments
Liquid nitrogen dewar, 5 litres	Thermo Fisher Scientific	TY509X1	Optional if cryopreserving tumor fragments
Matrigel® Matrix GFR, LDEV-Free, 5 ml	Corning Life Sciences	356230	Optional. Also available in 10 ml size (354230)
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002549	Pellet cells at 1200 rpm for 5-6 minutes
Mr. Frosty freezing containiner	Fisher Scientific	10110051	Optional if cryopreserving tumor fragments
NAIR Hair remover lotion/oil	Thermo Fisher Scientific	NC0132811	Can alternatively use an electric clipper with fine blade
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	None
Scalpel handle, #7 Short	Fine Science Tools, Inc.	10007-12	User preference as long as it accepts #15 scalpel blade
Small animal heated pad	VetTech	HE006	None
Stereomicroscope	GT Vision Ltd.	H600BV1	None
Sterile phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010023	Use for injections and also as part of the surgical scrub, alternating with chlorhexidine
Tissue adhesive (sterile)	3M Corporation	84-1469SB	Can alternatively use non-absorbable skin suture (6-0 size)
Trypan blue	Thermo Fisher Scientific	5250061	None
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25300054	Use 0.05%-0.25%
Tuberculin syringe (1 ml with 0.1 ml gradations)	Becton Dickinson	309659	Slip tip preferred over Luer
Vented tissue culture flasks, T-75	Corning Life Sciences	CLS3290	Can also use smaller or larger flasks, as needed