Summary

מידול גידולי עצם ראשוניים וגרורות עצם עם השתלת גידול מוצק השתלת עצם לעצם

Published: September 09, 2020
doi:

Summary

מודלים של גרורות בעצמות אינם מפתחים גרורות באופן אחיד או בשכיחות של 100%. הזרקה ישירה של תאי גידול תוך אוסאוסיים עלולה לגרום לתסחיף של הריאה. אנו מציגים את הטכניקה שלנו מידול גידולי עצם ראשוניים וגרורות עצם באמצעות השתלת גידול מוצק לתוך העצם, המוביל לקליטה וצמיחה הניתנים לשחזור.

Abstract

גידולי עצם ראשוניים או גרורות עצם מגידולים מוצקים גורמים לנגעים אוסטאוליטיים, אוסטאובלסטיים או מעורבים אוסטאוליטיים/אוסטאובלסטיים כואבים. נגעים אלה פוגעים במבנה העצם, מגבירים את הסיכון לשבר פתולוגי ומשאירים את המטופלים עם אפשרויות טיפול מוגבלות. גידולי עצם ראשוניים שולחים גרורות לאיברים מרוחקים, כאשר סוגים מסוימים מסוגלים להתפשט לאתרי שלד אחרים. עם זאת, ראיות עדכניות מצביעות על כך שבגידולים מוצקים רבים, תאים סרטניים שהתפשטו לעצם עשויים להיות המקור העיקרי לתאים שבסופו של דבר שולחים גרורות למערכות איברים אחרות. רוב המודלים הסינגניים או הקסנוגרפטים של גידולי עצם ראשוניים כוללים הזרקה תוך-אוסית (אורתוטופית) של תרחיפים של תאי גידול. חלק מהמודלים של בעלי חיים של גרורות שלד מגידולים מוצקים תלויים גם בהזרקת עצם ישירה, בעוד שאחרים מנסים לשחזר שלבים נוספים של מפל גרורות העצם על ידי הזרקת תאים תוך כלי דם או לתוך האיבר של הגידול הראשוני. עם זאת, אף אחד מהמודלים הללו אינו מפתח גרורות בעצמות באופן אמין או עם שכיחות של 100%. בנוסף, הזרקה תוך-אוסית ישירה של תאי הגידול הוכחה כקשורה לאמבוליזציה פוטנציאלית של הריאה. תאי גידול תסחיף אלה מושתלים אך אינם משחזרים את המפל הגרורתי. דיווחנו על מודל עכברי של אוסטאוסרקומה שבו קטעי גידול טריים או קריוגניים (המורכבים מתאי גידול בתוספת סטרומה) מושתלים ישירות לתוך השוקה הפרוקסימלית באמצעות טכניקה כירורגית זעיר פולשנית. בעלי חיים אלה פיתחו קליטה ניתנת לשחזור, גדילה, ועם הזמן, אוסטאוליזה וגרורות ריאה. טכניקה זו יש את הרבגוניות לשמש כדי מודל גרורות עצם הגידול מוצק יכול בקלות להשתמש שתלים המורכבים סוג תא אחד או יותר, תאים מהונדסים גנטית, xenografts נגזר המטופל, ו / או תאים מסומנים שניתן לעקוב אחריהם על ידי הדמיה אופטית או מתקדמת. כאן, אנו מדגימים טכניקה זו, מידול גידולי עצם ראשוניים וגרורות עצם באמצעות השתלת גידול מוצק השתלת עצם.

Introduction

מודלים עכבריים של מחלות בני אדם ובעלי חיים הופכים פופולריים יותר ויותר במחקר ביו-רפואי. התועלת בשימוש בעכברים בהקשר זה היא שהאנטומיה והפיזיולוגיה שלהם דומות מאוד לבני אדם. יש להם תקופת הריון קצרה יחסית וזמן בחיים שלאחר הלידה כדי להשיג בגרות, והם קשורים במידה רבה עם עלות נמוכה יחסית וקלות דיור, אם כי עלויות גדלות של פיתוח או רכישה קשורות עם דרגות גבוהות יותר של שינוי גנטי, כשל חיסוני, ו / או הומניזציה1. שימוש בזנים גזעיים מביא לאוכלוסיית בעלי חיים אחידה במידה רבה לפני הכללת המחקר. ידע מלא של הגנום שלהם מצביע על רמה גבוהה של דמיון לבני אדם. מטרות מולקולריות אורתולוגיות לתהליכי מחלה רבים זוהו בגנום העכבר וכיום יש ספרייה נרחבת של ריאגנטים ספציפיים לעכבר שניתן להשיג בקלות. לכן, הם מספקים הזדמנות לניתוח תפוקה גבוהה יחסית באופן מהיר יותר וזול יותר בהשוואה למודלים גדולים יותר של בעלי חיים1. בנוסף, עם כניסתן של אסטרטגיות עריכה גנטית המאפשרות ביטוי יתר או מחיקה של גנים מסוימים באופן גלובלי או ספציפי לסוג התא ו / או באופן מכונן או אינדוקטיבי, הם מייצגים מערכת מודל שימושית מאוד מבחינה ביולוגית לחקר מחלות בני אדם ובעלי חיים2.

סרטן הוא תחום אחד שבו מודלים עכבר יש תועלת רבה. מודלים גנטיים של סרטן בעכברים מסתמכים על אפנון הביטוי של אונקוגנים או גנים מדכאי גידולים, לבד או בשילוב, כדי שתאים יעברו טרנספורמציה אונקוגנית. הזרקת קווי תאי גידול ראשוניים או מבוססים לעכברים מבוצעת גם. הכנסת קווי תאים או רקמות מבני אדם או ממיני בעלי חיים אחרים, כולל עכברים, נותרה המודל הנפוץ ביותר של סרטן in vivo. השימוש בתאים ורקמות ממינים שונים (xenografts) בעכברים מדוכאי חיסון מבוצע לרוב2. עם זאת, השימוש בתאי גידול אלוגרפט או רקמות שבהן גם המארח וגם המקבל הם מאותו מין מאפשר אינטראקציה עם מערכת חיסון שלמה בשילוב עם אותו זן עכבר מארח במערכות סינגניות3.

גידולי עצם ראשוניים או גרורות עצם מגידולים מוצקים גורמים לנגעים אוסטאוליטיים, אוסטאובלסטיים או מעורבים אוסטאוליטיים/אוסטאובלסטיים 3,4. גידולים אלה פוגעים במבנה העצם, מגבירים את הסיכון לשבר פתולוגי ומשאירים את החולים עם אפשרויות טיפול מוגבלות. גידולי עצם ראשוניים שולחים גרורות לאיברים מרוחקים, כאשר סוגים מסוימים מסוגלים להתפשט לאתרי שלד אחרים. בחולות סרטן השד, העצם היא האתר השכיח ביותר של גרורות ראשונות והאתר הראשון השכיח ביותר של הצגת מחלה גרורתית 5,6. בנוסף, תאי גידול מפוזרים (DTC) נמצאים במח העצם לפני האבחנה של, ומנבאים את התפתחותן, של גרורות באיברים אחרים7. לכן, הוא האמין כי תאים סרטניים נוכח עצם הם המקור של תאים כי בסופו של דבר גרורות למערכות איברים אחרים. קיימים מודלים עכבריים רבים של גרורות גידוליות מוצקות המפתחות גרורות בעיקר בריאה ובבלוטות הלימפה, ובהתאם לסוג הגידול וטכניקת ההזרקה, אולי מערכות איברים אחרות3. עם זאת, חסרים מודלים עכבריים של גרורות עצם שמייצרים באופן מהימן גרורות שלד ספציפיות לאתר ומפתחות גרורות עצם לפני שהעכברים מגיעים לקריטריונים להסרה מוקדמת מנטל הגידול הראשוני או גרורות לאיברים אחרים. דיווחנו על מודל של אוסטאוסרקומה של גידול העצם הראשוני המסתמך על השתלה כירורגית של אלוגרפט גידול מוצק לתוך השוקה הפרוקסימלית של עכברים8. גידולי עצם נוצרו ב-100% מהעכברים וב-88% פיתחו גרורות ריאתיות. שכיחות זו של גרורות עולה על מה שמדווח קלינית בדרך כלל אצל אנשים (~ 20-50%), אך היא מעניינת מאוד מכיוון שהריאה היא האתר השכיח ביותר של גרורות לאוסטאוסרקומה 9,10,11. בעוד מודל זה הוא יתרון במידול גידולי עצם ראשוניים, יש לו גם תועלת רבה במידול גרורות עצם מגידולים מוצקים אוסטאוטרופיים אחרים כגון שד, ריאות, ערמונית, בלוטת התריס, כבד, כליות וגידולים במערכת העיכול.

הרציונל לפיתוח מודל זה היה לפתח חלופה להזרקה התוך-אוסית המסורתית בדרך כלל לתוך השוקה הפרוקסימלית או עצם הירך הדיסטלית כדי למדל גידולי עצם ראשוניים או גרורות עצם12. המטרה העיקרית שלנו הייתה להקל על מגבלה ידועה של טכניקה זו, כלומר אמבוליזציה של הגידול של הריאה. התוצאה היא קליטה של תאי גידול תסחיפים אלה ו”גרורות מלאכותיות” שאינן משחזרות את המפל הגרורתי המלא מגידול עצם ראשוני מבוסס ששולח גרורות לריאות 8,13. זה יהיה גם המצב כאשר גרורות עצם מבוססות מתפשטות לאתר מרוחק. בנוסף, טכניקה זו פותחה גם כדי לייצר מודל של גרורות עצם שיבטיח שכיחות גבוהה יותר של השתלה וצמיחה של גידולים בעצם ובאתר אחיד בהשוואה לטכניקות הזרקה אורתוטופיות או תוך וסקולריות. למודל זה יתרונות מובהקים על פני טכניקות מתוארות אלה. מודל זה כולל העברה מבוקרת ועקבית של תאי הגידול לתוך העצם. כמו כן, הוא מונע גרורות ריאה מלאכותיות לאחר אמבוליזציה ריאתית ומבסס אוכלוסיית מחקר אחידה בסיסית. יש יתרון של גידולים ספציפיים לאתר עם מודל זה ללא הסיכון של קריטריונים להסרה מוקדמת כתוצאה מגידולים ראשוניים או גרורות לאיברים אחרים. לבסוף, מודל זה יש תועלת רבה לשינוי, כולל השימוש xenografts נגזר המטופל.

למודל המוצג יש קווי דמיון להזרקת תרחיף תאים ישיר לעצם בעקבות גישה כירורגית ואחריה הזרקה דרך קליפת המוח או העברה לחלל המח לאחר ביצוע פגם קטן בקליפת המוח (עם או בלי כריתה של החלל המדולרי)8,14,15,16,17. עם זאת, ההשתלה של אלוגרפט גידולי הופכת טכניקה זו לשונה במובהק. לכן, מטרת דו”ח זה הייתה להדגים מודל זה של גידולי עצם ראשוניים וגרורות עצם מגידולים מוצקים, המתגבר על מגבלות רבות של מודלים שתוארו קודם לכן. קבוצות מחקר בעלות ניסיון בתרביות תאים, מודלים של עכברים, הרדמה וניתוחים של עכברים ואנטומיה של עכברים מצוידות היטב כדי לשחזר את הטכניקה שלנו למדל גידולי עצם ראשוניים או גרורות עצם בעכברים.

Protocol

כל הניסויים המתוארים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת קיימברידג’, קיימברידג’, בריטניה. 1. הכנת קווי תאים לגדל קווי תאים בהתאם לפרוטוקולי תרביות התאים הסטנדרטיים של המעבדה לתרבית תאים מסורתית או הזרקה לעכברים. פרוטוקולים סטנ…

Representative Results

תוצאה חיובית תהיה קשורה לקליטת הגידול ולצמיחת הגידול המתקדמת לאורך זמן. בהתאם לסוג הגידול, גידול תוך אוסוסי עשוי להיות קשור לצליעה מתקדמת בגפיים האחוריות, אך גידולים רבים אינם גורמים לצליעה למרות סימנים של מחלת עצם נלווית. השתלה מוצלחת תועדה באמצעות הדמיה מתקדמת, לפיה יהיו שינויים רדיוגר…

Discussion

דו”ח זה מתעד את המודל שלנו ליצירת גידולי עצם ראשוניים או גרורות עצם לאחר השתלה תוך טיביאלית של אלוגרפט גידולי. אנו מאמינים כי ישנם מספר שלבים קריטיים בתהליך זה. יש לקבוע מישור הרדמה בטוח הן להזרקה תת עורית של תרחיף תאי הגידול והן למיקום תוך טיביאלי של שברי הגידול המתקבלים. צריכה להיות הכנה ?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מכירים בתרומתה הקריטית של ד”ר בת’ צ’אפי, DVM, PhD, DACVP לפיתוח טכניקה זו.

Materials

#15 scalpel blade Henry Schein Ltd. 75614 None
6-well tissue culture plates Thermo Fisher Scientific 10578911 Used for mincing tumor pieces. Can also be used for cell culture
Abrams osteosarcoma cell line Not applicable Not applicable None
Anesthesia machine with isoflurane vaporiser and oxygen tank(s) VetEquip 901805 None
Animal weighing scale Kent Scientific SCL- 1015 None
BALB/c nude mouse (nu/nu) Charles River Ltd. NA 6-8 weeks of age. Male or female mice
Bone cement Depuy Synthes 160504 Optional use instead of bone wax
Bone wax Ethicon W31G Optional
Buprenorphine Animalcare Ltd. N/A Buprecare 0.3 mg/ml Solution for Injection for Dogs and Cats
Carbon dioxide euthanasia station N/A N/A Should be provided within animal facility
Cell culture incubator set at 37 °C and 5% carbon dioxide Heraeus Various None
Chlorhexidine surgical scrub Vetoquinol 411412 None
Cryovials (2 ml) Thermo Scientific Nalgene 5000-0020 Optional if cryopreserving tumor fragments
D-luciferin (Firefly), potassium salt Perkin Elmer 122799 Optional if cell line of interest has a bioluminescent reporter gene
Digital caliper Mitutoyo 500-181-30 Can be manual
Digital microradiography cabinet Faxitron Bioptics, LLC MX-20 Optional to evaluate bone response to tumor growth
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich 1371171000 Optional if cryopreserving tumor fragments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium Thermo Fisher Scientific 11965092 None
Ethanol (70%) Sigma Aldrich 2483 None
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 26140079 None
Forceps, Dumont Fine Science Tools, Inc. 11200-33 None
Freezer (– 80 °C) Sanyo MDF-794C Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments
Hemocytometer Thermo Fisher Scientific 11704939 Can also use automated cell counter, if available
Hypodermic needles (27 gauge) Henry Schein Ltd. DIS55510 May also use 25G (DIS55509) and 30G (Catalog DIS599) needles
Ice N/A N/A Ideally small pieces in a container for syringe and cell suspension storage
Iris scissors Fine Science Tools, Inc. 14084-08 None
Isoflurane Henry Schein Ltd. 1182098 None
IVIS Lumina III bioluminescence/fluorescence imaging system Perkin Elmer CLS136334 Optional if cell line of interest has bioluminescent or fluorescent reporter genes
L-glutamine Thermofisher scientifc 25030081 None
Liquid nitrogen British Oxygen Corporation NA Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments
Liquid nitrogen dewar, 5 litres Thermo Fisher Scientific TY509X1 Optional if cryopreserving tumor fragments
Matrigel® Matrix GFR, LDEV-Free, 5 ml Corning Life Sciences 356230 Optional. Also available in 10 ml size (354230)
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002549 Pellet cells at 1200 rpm for 5-6 minutes
Mr. Frosty freezing containiner Fisher Scientific 10110051 Optional if cryopreserving tumor fragments
NAIR Hair remover lotion/oil Thermo Fisher Scientific NC0132811 Can alternatively use an electric clipper with fine blade
Penicillin/streptomycin Sigma-Aldrich P4333 None
Scalpel handle, #7 Short Fine Science Tools, Inc. 10007-12 User preference as long as it accepts #15 scalpel blade
Small animal heated pad VetTech HE006 None
Stereomicroscope GT Vision Ltd. H600BV1 None
Sterile phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010023 Use for injections and also as part of the surgical scrub, alternating with chlorhexidine
Tissue adhesive (sterile) 3M Corporation 84-1469SB Can alternatively use non-absorbable skin suture (6-0 size)
Trypan blue Thermo Fisher Scientific 5250061 None
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25300054 Use 0.05%-0.25%
Tuberculin syringe (1 ml with 0.1 ml gradations) Becton Dickinson 309659 Slip tip preferred over Luer
Vented tissue culture flasks, T-75 Corning Life Sciences CLS3290 Can also use smaller or larger flasks, as needed

Riferimenti

  1. Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
  2. Vandamme, T. F. Use of rodents as models of human diseases. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 6 (1), 2-9 (2014).
  3. Simmons, J. K., et al. Animal Models of Bone Metastasis. Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).
  4. Wolfe, T. D., et al. Effect of zoledronic acid and amputation on bone invasion and lung metastasis of canine osteosarcoma in nude mice. Clinical and Experimental Metastasis. 28 (4), 377-389 (2011).
  5. Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).
  6. James, J. J., et al. metastases from breast carcinoma: histopathological – radiological correlations and prognostic features. British Journal of Cancer. 89 (4), 660-665 (2003).
  7. Pantel, K., Brakenhoff, R. H. Dissecting the metastatic cascade. Nature Reviews Cancer. 4 (6), 448-456 (2004).
  8. Chaffee, B. K., Allen, M. J. A clinically relevant mouse model of canine osteosarcoma with spontaneous metastasis. In Vivo. 27 (5), 599-603 (2013).
  9. Munajat, I., Zulmi, W., Norazman, M. Z., Wan Faisham, W. I. Tumour volume and lung metastasis in patients with osteosarcoma. Journal of Orthopaedic Surgery (Hong Kong). 16 (2), 182-185 (2008).
  10. Huang, X., et al. Risk and clinicopathological features of osteosarcoma metastasis to the lung: A population-based study. Journal of Bone Oncology. 16, 100230 (2019).
  11. Li, W., Zhang, S. Survival of patients with primary osteosarcoma and lung metastases. Journal of BUON. 23 (5), 1500-1504 (2018).
  12. Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. Journal of Visualized Experiments. (67), e4260 (2012).
  13. Maloney, C., et al. Intratibial Injection Causes Direct Pulmonary Seeding of Osteosarcoma Cells and Is Not a Spontaneous Model of Metastasis: A Mouse Osteosarcoma Model. Clinical Orthopedics and Related Research. 476 (7), 1514-1522 (2018).
  14. Dai, J., Hensel, J., Wang, N., Kruithof-de Julio, M., Shiozawa, Y. Mouse models for studying prostate cancer bone metastasis. BoneKey Reports. 5, 777 (2016).
  15. Marques da Costa, M. E., et al. Establishment and characterization of in vivo orthotopic bioluminescent xenograft models from human osteosarcoma cell lines in Swiss nude and NSG mice. Cancer Medicine. 7 (3), 665-676 (2018).
  16. Raheem, O., et al. A novel patient-derived intra-femoral xenograft model of bone metastatic prostate cancer that recapitulates mixed osteolytic and osteoblastic lesions. Journal of Translational Medicine. 9, 185 (2011).
  17. Sasaki, H., Iyer, S. V., Sasaki, K., Tawfik, O. W., Iwakuma, T. An improved intrafemoral injection with minimized leakage as an orthotopic mouse model of osteosarcoma. Analytical Biochemistry. 486, 70-74 (2015).
  18. Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
  19. Yu, C., et al. Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (115), e53982 (2016).
  20. Kuchimaru, T., et al. A reliable murine model of bone metastasis by injecting cancer cells through caudal arteries. Nature Communications. 9 (1), 2981 (2018).
  21. Haley, H. R., et al. Enhanced Bone Metastases in Skeletally Immature Mice. Tomography. 4 (2), 84-93 (2018).
  22. Lei, Z. G., Ren, X. H., Wang, S. S., Liang, X. H., Tang, Y. L. Immunocompromised and immunocompetent mouse models for head and neck squamous cell carcinoma. Onco Targets and Therapy. 9, 545-555 (2016).
  23. Lefley, D., et al. Development of clinically relevant in vivo metastasis models using human bone discs and breast cancer patient-derived xenografts. Breast Cancer Research. 21 (1), 130 (2019).
  24. Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
check_url/it/61313?article_type=t

Play Video

Citazione di questo articolo
Hildreth III, B. E., Palmer, C., Allen, M. J. Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone. J. Vis. Exp. (163), e61313, doi:10.3791/61313 (2020).

View Video