Summary

Modelagem de Tumores Ósseos Primários e Metástases Ósseas com Implante de Enxerto Sólido de Tumor em Osso

Published: September 09, 2020
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Summary

Os modelos de metástases ósseas não desenvolvem metástases uniformemente ou com 100% de incidência. A injeção direta intraóssea de células tumorais pode resultar em embolização do pulmão. Apresentamos nossa técnica de modelagem de tumores ósseos primários e metástases ósseas usando o implante de enxerto de tumor sólido no osso, levando a enxertia e crescimento reprodutíveis.

Abstract

Tumores ósseos primários ou metástases ósseas de tumores sólidos resultam em lesões osteolíticas, osteoblásticas ou mistas osteolíticas/osteoblásticas dolorosas. Essas lesões comprometem a estrutura óssea, aumentam o risco de fratura patológica e deixam os pacientes com opções limitadas de tratamento. Os tumores ósseos primários metastatizam para órgãos distantes, com alguns tipos capazes de se espalhar para outros sítios esqueléticos. No entanto, evidências recentes sugerem que, com muitos tumores sólidos, as células cancerosas que se espalharam para o osso podem ser a fonte primária de células que, em última análise, metastatizam para outros sistemas orgânicos. A maioria dos modelos singênicos ou xenoenxertos de tumores ósseos primários em camundongos envolve injeção intraóssea (ortotópica) de suspensões de células tumorais. Alguns modelos animais de metástase esquelética de tumores sólidos também dependem de injeção óssea direta, enquanto outros tentam recapitular etapas adicionais da cascata metastática óssea injetando células intravascularmente ou no órgão do tumor primário. No entanto, nenhum desses modelos desenvolve metástases ósseas de forma confiável ou com incidência de 100%. Além disso, a injeção intraóssea direta de células tumorais tem se mostrado associada a potencial embolização tumoral do pulmão. Essas células tumorais embólicas enxertam mas não recapitulam a cascata metastática. Relatamos um modelo de osteossarcoma em camundongo no qual fragmentos tumorais frescos ou criopreservados (consistindo de células tumorais mais estroma) são implantados diretamente na tíbia proximal usando uma técnica cirúrgica minimamente invasiva. Esses animais desenvolveram enxerto, crescimento e, ao longo do tempo, osteólise e metástase pulmonar. Esta técnica tem a versatilidade de ser usada para modelar metástases ósseas tumorais sólidas e pode prontamente empregar enxertos consistindo de um ou vários tipos celulares, células geneticamente modificadas, xenoenxertos derivados do paciente e/ou células marcadas que podem ser rastreadas por imagens ópticas ou avançadas. Demonstramos esta técnica, modelando tumores ósseos primários e metástases ósseas utilizando o implante de enxerto de tumor sólido no osso.

Introduction

Modelos de camundongos de doenças humanas e animais estão se tornando cada vez mais populares na pesquisa biomédica. A utilidade do uso de camundongos nesse contexto é que sua anatomia e fisiologia são muito semelhantes às dos seres humanos. Apresentam um período de gestação relativamente curto e um tempo na vida pós-natal para atingir a maturidade, e estão em grande parte associados a um custo relativamente baixo e à facilidade de moradia, embora os custos crescentes de desenvolvimento ou compra estejam associados a maiores graus de modificação genética, imunodeficiência e/ou humanização1. O uso de linhagens endogâmicas resulta em uma população animal amplamente uniforme antes da inclusão no estudo. Um conhecimento completo de seu genoma sugere um alto grau de semelhança com os seres humanos. Alvos moleculares ortólogos para muitos processos de doenças foram identificados no genoma de camundongos e agora há uma extensa biblioteca de reagentes específicos de camundongos que são facilmente obtidos. Portanto, eles fornecem a oportunidade de análises de rendimento relativamente alto de maneira mais rápida e menos dispendiosa quando comparados a modelos animais maiores1. Além disso, com o advento de estratégias de edição genética que permitem a superexpressão ou deleção de certos genes, seja globalmente ou de maneira específica do tipo celular e/ou constitutivamente ou de forma induzível, elas representam um sistema modelo biologicamente muito útil para a investigação de doenças humanas eanimais2.

O câncer é um campo em que os modelos de camundongos têm grande utilidade. Modelos genéticos de câncer em camundongos dependem da modulação da expressão de oncogenes ou genes supressores de tumor, isoladamente ou em combinação, para que as células sofram transformação oncogênica. A injeção de linhagens de células tumorais primárias ou estabelecidas em camundongos também é realizada. A introdução de linhagens celulares ou tecidos de humanos ou outras espécies animais, incluindo camundongos, continua sendo o modelo mais amplamente utilizado de câncer in vivo. O uso de células e tecidos de espécies diferentes (xenoenxertos) em camundongos imunocomprometidos é mais comumente realizado2. No entanto, o uso de células ou tecidos tumorais aloenxertos onde tanto o hospedeiro quanto o receptor são da mesma espécie permite a interação com um sistema imune intacto quando combinado com a mesma linhagem hospedeira em sistemas singênicos3.

Tumores ósseos primários ou metástases ósseas de tumores sólidos resultam em lesões osteolíticas, osteoblásticas ou mistas osteolíticas/osteoblásticasdolorosas3,4. Esses tumores comprometem a estrutura óssea, aumentando o risco de fratura patológica, e deixam os pacientes com opções limitadas de tratamento. Os tumores ósseos primários metastatizam para órgãos distantes, com alguns tipos capazes de se espalhar para outros sítios esqueléticos. Em pacientes com câncer de mama, o osso é o sítio mais comum da primeira metástase e o primeiro local mais frequente de apresentação da doençametastática5,6. Além disso, células tumorais disseminadas (CDTs) estão presentes na medula óssea antes do diagnóstico e predizem o desenvolvimento de metástases em outrosórgãos7. Portanto, acredita-se que as células cancerosas presentes no osso são a fonte de células que, em última análise, metastatizam para outros sistemas orgânicos. Existem muitos modelos murinos de metástases tumorais sólidas que desenvolvem metástases predominantemente pulmonares e linfonodais e, dependendo do tipo de tumor e da técnica de injeção, potencialmente de outros sistemasorgânicos3. No entanto, faltam modelos de metástase óssea em camundongos que produzam metástases esqueléticas sítio-específicas de forma confiável e reprodutível e desenvolvam metástases ósseas antes que os camundongos atinjam critérios de remoção precoce da carga tumoral primária ou metástase para outros órgãos. Relatamos um modelo de osteossarcoma de tumor ósseo primário que se baseia no implante cirúrgico de um aloenxerto de tumor sólido na tíbia proximal decamundongos8. Tumores ósseos se formaram em 100% dos camundongos e 88% desenvolveram metástase pulmonar. Essa incidência de metástase excede o que é comumente relatado clinicamente em pessoas (~20-50%), mas é de grande interesse, uma vez que o pulmão é o sítio mais comum de metástase para osteossarcoma9,10,11. Embora esse modelo seja vantajoso na modelagem de tumores ósseos primários, ele também tem grande utilidade na modelagem de metástases ósseas de outros tumores sólidos osteotrópicos, como mama, pulmão, próstata, tireoide, hepatic, renal e gastrointestinal.

A justificativa para o desenvolvimento desse modelo foi desenvolver uma alternativa à tradicional injeção intraóssea tipicamente na tíbia proximal ou fêmur distal para modelar tumores ósseos primários ou metástasesósseas12. Nosso objetivo primário foi aliviar uma conhecida limitação dessa técnica, a embolização tumoral do pulmão. Isso resulta no enxerto dessas células tumorais embólicas e “metástases artefatuais” que não recapitulam a cascata metastática completa de um tumor ósseo primário estabelecido que metastatiza para os pulmões 8,13. Esta também seria a situação em que uma metástase óssea estabelecida se espalha para um local distante. Além disso, essa técnica também foi desenvolvida para produzir um modelo de metástase óssea que garantisse maior incidência de enxertia e crescimento de tumores no osso e em local uniforme quando comparada com técnicas de injeção ortotópica ou intravascular. Este modelo apresenta vantagens distintas sobre essas técnicas descritas. Este modelo envolve a entrega controlada e consistente de células tumorais no osso. Também evita metástases pulmonares artefatuais após embolização pulmonar e estabelece uma população basal uniforme do estudo. Há o benefício de tumores sítio-específicos com esse modelo, sem o risco de critérios de remoção precoce resultantes de tumores primários ou metástases para outros órgãos. Por fim, esse modelo tem grande utilidade para modificação, incluindo o uso de xenoenxertos derivados do paciente.

O modelo apresentado tem semelhanças com a injeção direta da suspensão celular no osso após uma abordagem cirúrgica seguida de injeção através do córtex ou entrega na cavidade medular após a confecção de um pequeno defeito no córtex (com ou sem fresagem da cavidade medular)8,14,15,16,17 . No entanto, o implante de um aloenxerto tumoral torna esta técnica distinta. Portanto, o objetivo deste relato foi demonstrar este modelo de tumores ósseos primários e metástases ósseas de tumores sólidos, o que supera muitas limitações dos modelos descritos anteriormente. Grupos de pesquisa com experiência em cultura de células, modelos de camundongos, anestesia e cirurgia em camundongos e anatomia de camundongos estão bem equipados para reproduzir nossa técnica para modelar tumores ósseos primários ou metástases ósseas em camundongos.

Protocol

Todos os experimentos com animais descritos foram aprovados pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade de Cambridge, Cambridge, Reino Unido. 1. Preparação das linhagens celulares Cultivar linhagens celulares de acordo com os protocolos padrão de cultura de células do laboratório para cultura de células tradicionais ou injeção em camundongos. Os protocolos padrão utilizados aqui são o crescimento em meio de Eagle modificado por Dulbecco contendo …

Representative Results

Um resultado positivo estaria associado à enxertia tumoral e ao crescimento progressivo do tumor ao longo do tempo. Dependendo do tipo de tumor, o crescimento intraósseo do tumor pode estar associado à claudicação progressiva dos membros posteriores, mas muitos tumores não causam claudicação, apesar dos sinais de doença óssea associada. O sucesso do enxerto foi documentado com exames de imagem avançados, nos quais haveria alterações radiográficas progressivas, na μTC ou na μRM da tíbia proximal associada…

Discussion

Este relato documenta nosso modelo para criar tumores ósseos primários ou metástases ósseas após o implante intratibial de um aloenxerto tumoral. Acreditamos que existem várias etapas críticas nesse processo. Um plano anestésico seguro deve ser estabelecido tanto para a injeção subcutânea da suspensão de células tumorais quanto para a colocação intratibial dos fragmentos tumorais resultantes. Deve haver preparo estéril do sítio cirúrgico tanto para a retirada do aloenxerto subcutâneo quanto para a colo…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem a contribuição crítica da Dra. Beth Chaffee, DVM, PhD, DACVP para o desenvolvimento desta técnica.

Materials

#15 scalpel blade Henry Schein Ltd. 75614 None
6-well tissue culture plates Thermo Fisher Scientific 10578911 Used for mincing tumor pieces. Can also be used for cell culture
Abrams osteosarcoma cell line Not applicable Not applicable None
Anesthesia machine with isoflurane vaporiser and oxygen tank(s) VetEquip 901805 None
Animal weighing scale Kent Scientific SCL- 1015 None
BALB/c nude mouse (nu/nu) Charles River Ltd. NA 6-8 weeks of age. Male or female mice
Bone cement Depuy Synthes 160504 Optional use instead of bone wax
Bone wax Ethicon W31G Optional
Buprenorphine Animalcare Ltd. N/A Buprecare 0.3 mg/ml Solution for Injection for Dogs and Cats
Carbon dioxide euthanasia station N/A N/A Should be provided within animal facility
Cell culture incubator set at 37 °C and 5% carbon dioxide Heraeus Various None
Chlorhexidine surgical scrub Vetoquinol 411412 None
Cryovials (2 ml) Thermo Scientific Nalgene 5000-0020 Optional if cryopreserving tumor fragments
D-luciferin (Firefly), potassium salt Perkin Elmer 122799 Optional if cell line of interest has a bioluminescent reporter gene
Digital caliper Mitutoyo 500-181-30 Can be manual
Digital microradiography cabinet Faxitron Bioptics, LLC MX-20 Optional to evaluate bone response to tumor growth
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich 1371171000 Optional if cryopreserving tumor fragments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium Thermo Fisher Scientific 11965092 None
Ethanol (70%) Sigma Aldrich 2483 None
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 26140079 None
Forceps, Dumont Fine Science Tools, Inc. 11200-33 None
Freezer (– 80 °C) Sanyo MDF-794C Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments
Hemocytometer Thermo Fisher Scientific 11704939 Can also use automated cell counter, if available
Hypodermic needles (27 gauge) Henry Schein Ltd. DIS55510 May also use 25G (DIS55509) and 30G (Catalog DIS599) needles
Ice N/A N/A Ideally small pieces in a container for syringe and cell suspension storage
Iris scissors Fine Science Tools, Inc. 14084-08 None
Isoflurane Henry Schein Ltd. 1182098 None
IVIS Lumina III bioluminescence/fluorescence imaging system Perkin Elmer CLS136334 Optional if cell line of interest has bioluminescent or fluorescent reporter genes
L-glutamine Thermofisher scientifc 25030081 None
Liquid nitrogen British Oxygen Corporation NA Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments
Liquid nitrogen dewar, 5 litres Thermo Fisher Scientific TY509X1 Optional if cryopreserving tumor fragments
Matrigel® Matrix GFR, LDEV-Free, 5 ml Corning Life Sciences 356230 Optional. Also available in 10 ml size (354230)
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002549 Pellet cells at 1200 rpm for 5-6 minutes
Mr. Frosty freezing containiner Fisher Scientific 10110051 Optional if cryopreserving tumor fragments
NAIR Hair remover lotion/oil Thermo Fisher Scientific NC0132811 Can alternatively use an electric clipper with fine blade
Penicillin/streptomycin Sigma-Aldrich P4333 None
Scalpel handle, #7 Short Fine Science Tools, Inc. 10007-12 User preference as long as it accepts #15 scalpel blade
Small animal heated pad VetTech HE006 None
Stereomicroscope GT Vision Ltd. H600BV1 None
Sterile phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010023 Use for injections and also as part of the surgical scrub, alternating with chlorhexidine
Tissue adhesive (sterile) 3M Corporation 84-1469SB Can alternatively use non-absorbable skin suture (6-0 size)
Trypan blue Thermo Fisher Scientific 5250061 None
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25300054 Use 0.05%-0.25%
Tuberculin syringe (1 ml with 0.1 ml gradations) Becton Dickinson 309659 Slip tip preferred over Luer
Vented tissue culture flasks, T-75 Corning Life Sciences CLS3290 Can also use smaller or larger flasks, as needed

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Hildreth III, B. E., Palmer, C., Allen, M. J. Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone. J. Vis. Exp. (163), e61313, doi:10.3791/61313 (2020).

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