Modellering av primära bentumörer och benmetastaser med solid tumörtransplantatimplantation i ben

Summary

Benmetastasmodeller utvecklar inte metastaser enhetligt eller med 100% förekomst. Direkt intraosseös tumörcellsinjektion kan resultera i embolisering av lungan. Vi presenterar vår teknik modellering primära bentumörer och benmetastaser med hjälp av solid tumörtransplantatimplantation i ben, vilket leder till reproducerbar engraftment och tillväxt.

Abstract

Primära bentumörer eller benmetastaser från solida tumörer resulterar i smärtsamma osteolytiska, osteoblastiska eller blandade osteolytiska / osteoblastiska lesioner. Dessa lesioner äventyrar benstrukturen, ökar risken för patologiska frakturer och lämnar patienter med begränsade behandlingsalternativ. Primära bentumörer metastaserar till avlägsna organ, med vissa typer som kan sprida sig till andra skelettplatser. Nya bevis tyder dock på att cancerceller som har spridit sig till ben med många solida tumörer kan vara den primära källan till celler som i slutändan metastaserar till andra organsystem. De flesta syngena eller xenograftmusmodeller av primära bentumörer involverar intraosseös (ortotopisk) injektion av tumörcellsuspensioner. Vissa djurmodeller av skelettmetastaser från solida tumörer beror också på direkt beninjektion, medan andra försöker rekapitulera ytterligare steg i benmetastaseringskaskaden genom att injicera celler intravaskulärt eller i organet i den primära tumören. Ingen av dessa modeller utvecklar emellertid benmetastaser på ett tillförlitligt sätt eller med en incidens på 100%. Dessutom har direkt intraossös injektion av tumörceller visat sig vara associerad med potentiell tumörembolisering av lungan. Dessa emboliska tumörceller transplanterar men rekapitulerar inte den metastatiska kaskaden. Vi rapporterade en musmodell av osteosarkom där färska eller kryokonserverade tumörfragment (bestående av tumörceller plus stroma) implanteras direkt i proximal tibia med hjälp av en minimalt invasiv kirurgisk teknik. Dessa djur utvecklade reproducerbar engraftment, tillväxt och över tiden osteolys och lungmetastaser. Denna teknik har mångsidigheten att användas för att modellera solid tumörbenmetastasering och kan lätt använda transplantat bestående av en eller flera celltyper, genetiskt modifierade celler, patienthärledda xenotransplantat och / eller märkta celler som kan spåras genom optisk eller avancerad bildbehandling. Här demonstrerar vi denna teknik, modellering av primära bentumörer och benmetastaser med hjälp av solid tumörtransplantatimplantation i ben.

Introduction

Musmodeller av sjukdomar hos människor och djur blir allt populärare inom biomedicinsk forskning. Nyttan med att använda möss i detta sammanhang är att deras anatomi och fysiologi är mycket lik människor. De har en relativt kort graviditetsperiod och tid i postnatalt liv för att uppnå mognad och är till stor del förknippade med en relativt låg kostnad och enkel bostad, även om ökande kostnader för utveckling eller inköp är förknippade med högre grader av genetisk modifiering, immunbrist och / eller humanisering¹. Användning av inavlade stammar resulterar i en i stort sett enhetlig djurpopulation före inkludering i studien. En fullständig kunskap om deras genom tyder på en hög grad av likhet med människor. Ortologa molekylära mål för många sjukdomsprocesser har identifierats i musgenomet och det finns nu ett omfattande bibliotek av musspecifika reagens som är lätta att få. Därför ger de möjlighet till analys med relativt hög genomströmning på ett snabbare och billigare sätt jämfört med större djurmodeller¹. Dessutom, med tillkomsten av genetiska redigeringsstrategier som möjliggör överuttryck eller radering av vissa gener antingen globalt eller på ett celltypspecifikt sätt och / eller konstitutivt eller på ett inducerbart sätt, representerar de ett mycket biologiskt användbart modellsystem för undersökning av sjukdomar hos människor och djur².

Cancer är ett område där musmodeller har stor nytta. Genetiska musmodeller av cancer är beroende av modulering av uttrycket av antingen onkogener eller tumörsuppressorgener, ensamma eller i kombination, för att celler ska genomgå onkogen transformation. Injektionen av primära eller etablerade tumörcellinjer i möss utförs också. Införandet av antingen cellinjer eller vävnader från människor eller andra djurarter, inklusive möss, är fortfarande den mest använda modellen för cancer in vivo. Användningen av celler och vävnader från olika arter (xenotransplantat) hos immunsupprimerade möss utförs oftast². Användningen av transplantattumörceller eller vävnader där både värden och mottagaren är av samma art möjliggör emellertid interaktion med ett intakt immunsystem i kombination med samma värdmusstam i syngena system³.

Primära bentumörer eller benmetastaser från solida tumörer resulterar i smärtsamma osteolytiska, osteoblastiska eller blandade osteolytiska / osteoblastiska lesioner ^3,4. Dessa tumörer äventyrar benstrukturen, ökar risken för patologisk fraktur och lämnar patienter med begränsade behandlingsalternativ. Primära bentumörer metastaserar till avlägsna organ, med vissa typer som kan sprida sig till andra skelettplatser. Hos bröstcancerpatienter är ben det vanligaste stället för första metastasering och det vanligaste första stället för presentation av metastaserad sjukdom ^5,6. Dessutom finns disseminerade tumörceller (DTC) i benmärgen före diagnos av och förutsäger utvecklingen av metastaser i andra organ⁷. Därför tror man att cancerceller som finns i ben är källan till celler som i slutändan metastaserar till andra organsystem. Det finns många musmodeller av solida tumörmetastaser som utvecklar metastaser främst i lung- och lymfkörtlarna, och beroende på tumörtyp och injektionsteknik, potentiellt andra organsystem³. Det saknas dock musmodeller av benmetastaser som på ett tillförlitligt sätt reproducerbart producerar platsspecifika skelettmetastaser och utvecklar benmetastaser innan möss når tidiga borttagningskriterier från primär tumörbörda eller metastasering till andra organ. Vi har rapporterat en modell av den primära bentumören osteosarkom som bygger på kirurgisk implantation av ett fast tumörallograft i proximal tibia hos möss⁸. Bentumörer bildades hos 100% av mössen och 88% utvecklade lungmetastaser. Denna incidens av metastaser överstiger vad som vanligen rapporteras kliniskt hos människor (~20-50%), men är av stort intresse eftersom lungan är den vanligaste platsen för metastaser för osteosarkom 9,10,11. Även om denna modell är fördelaktig vid modellering av primära bentumörer, har den också stor nytta vid modellering av benmetastaser från andra osteotropa solida tumörer såsom bröst-, lung-, prostata-, sköldkörtel-, lever-, njur- och gastrointestinala tumörer.

Anledningen till utvecklingen av denna modell var att utveckla ett alternativ till den traditionella intraosseösa injektionen, vanligtvis i proximal tibia eller distalt lårben, för att modellera primära bentumörer eller benmetastaser¹². Vårt primära mål var att lindra en känd begränsning av denna teknik, dvs tumörembolisering av lungan. Detta resulterar i engraftment av dessa emboliska tumörceller och “artefaktisk metastasering” som inte rekapitulerar den fullständiga metastatiska kaskaden från en etablerad primär bentumör som metastaserar till lungorna ^8,13. Detta skulle också vara situationen när en etablerad benmetastas sprider sig till en avlägsen plats. Dessutom utvecklades denna teknik också för att producera en modell av benmetastaser som skulle säkerställa en större förekomst av engraftment och tillväxt av tumörer i ben och på en enhetlig plats jämfört med ortotopisk eller intravaskulär injektionsteknik. Denna modell har tydliga fördelar jämfört med dessa beskrivna tekniker. Denna modell innebär kontrollerad, konsekvent leverans av tumörceller i benet. Det undviker också artefaktisk lungmetastasering efter lungembolisering och etablerar en enhetlig studiepopulation vid baslinjen. Det finns fördelen med platsspecifika tumörer med denna modell utan risk för tidiga borttagningskriterier till följd av primära tumörer eller metastaser till andra organ. Slutligen har denna modell stor nytta för modifiering, inklusive användning av patient-härledda xenotransplantat.

Den presenterade modellen har likheter med direkt cellsuspension, injektion i ben, efter ett kirurgiskt tillvägagångssätt följt av antingen injektion genom cortex eller leverans i märghålan efter att ha gjort en liten defekt i cortex (med eller utan brotschning ut ur medulärhålan)8,14,15,16,17 . Implantationen av en tumörallograft gör emellertid denna teknik tydligt annorlunda. Syftet med denna rapport var därför att demonstrera denna modell av primära bentumörer och benmetastaser från solida tumörer, vilket övervinner många begränsningar av tidigare beskrivna modeller. Forskargrupper med erfarenhet av cellodling, musmodeller, musanestesi och kirurgi samt musanatomi är väl rustade för att reproducera vår teknik för att modellera primära bentumörer eller benmetastaser hos möss.

Protocol

Alla beskrivna djurförsök godkändes av den institutionella djurvårds- och användningskommittén vid University of Cambridge, Cambridge, Storbritannien. 1. Beredning av cellinjer Odla cellinjer i enlighet med laboratoriets standardcellodlingsprotokoll för traditionell cellodling eller injektion i möss. Standardprotokoll som används här är tillväxt i Dulbeccos modifierade Eagles medium innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS), L-glutamin och penicillin / streptomycin (ned…

Representative Results

Ett positivt resultat skulle vara förknippat med tumörgravering och progressiv tumörtillväxt över tiden. Beroende på tumörtyp kan intraosseös tumörtillväxt associeras med progressiv hälta i bakbenen, men många tumörer orsakar inte hälta trots tecken på åtföljande bensjukdom. Framgångsrik engraftment dokumenterades med avancerad avbildning, varigenom det skulle finnas progressiva radiografiska, μCT- eller μMRI-förändringar i den proximala skenbenet associerade med benfenotypen för cellinjen av intre…

Discussion

Denna rapport dokumenterar vår modell för att skapa primära bentumörer eller benmetastaser efter intratibial implantation av en tumörallograft. Vi anser att det finns flera kritiska steg i denna process. Ett säkert anestesiplan bör upprättas för både subkutan injektion av tumörcellsuspensionen och intratibiell placering av de resulterande tumörfragmenten. Det bör finnas steril förberedelse av operationsområdet för både avlägsnande av subkutan allograft och intratibiell placering av allograften. Tumöral…

Materials

#15 scalpel blade	Henry Schein Ltd.	75614	None
6-well tissue culture plates	Thermo Fisher Scientific	10578911	Used for mincing tumor pieces. Can also be used for cell culture
Abrams osteosarcoma cell line	Not applicable	Not applicable	None
Anesthesia machine with isoflurane vaporiser and oxygen tank(s)	VetEquip	901805	None
Animal weighing scale	Kent Scientific	SCL- 1015	None
BALB/c nude mouse (nu/nu)	Charles River Ltd.	NA	6-8 weeks of age. Male or female mice
Bone cement	Depuy Synthes	160504	Optional use instead of bone wax
Bone wax	Ethicon	W31G	Optional
Buprenorphine	Animalcare Ltd.	N/A	Buprecare 0.3 mg/ml Solution for Injection for Dogs and Cats
Carbon dioxide euthanasia station	N/A	N/A	Should be provided within animal facility
Cell culture incubator set at 37 °C and 5% carbon dioxide	Heraeus	Various	None
Chlorhexidine surgical scrub	Vetoquinol	411412	None
Cryovials (2 ml)	Thermo Scientific Nalgene	5000-0020	Optional if cryopreserving tumor fragments
D-luciferin (Firefly), potassium salt	Perkin Elmer	122799	Optional if cell line of interest has a bioluminescent reporter gene
Digital caliper	Mitutoyo	500-181-30	Can be manual
Digital microradiography cabinet	Faxitron Bioptics, LLC	MX-20	Optional to evaluate bone response to tumor growth
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	1371171000	Optional if cryopreserving tumor fragments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	None
Ethanol (70%)	Sigma Aldrich	2483	None
Fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	26140079	None
Forceps, Dumont	Fine Science Tools, Inc.	11200-33	None
Freezer (– 80 °C)	Sanyo	MDF-794C	Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments
Hemocytometer	Thermo Fisher Scientific	11704939	Can also use automated cell counter, if available
Hypodermic needles (27 gauge)	Henry Schein Ltd.	DIS55510	May also use 25G (DIS55509) and 30G (Catalog DIS599) needles
Ice	N/A	N/A	Ideally small pieces in a container for syringe and cell suspension storage
Iris scissors	Fine Science Tools, Inc.	14084-08	None
Isoflurane	Henry Schein Ltd.	1182098	None
IVIS Lumina III bioluminescence/fluorescence imaging system	Perkin Elmer	CLS136334	Optional if cell line of interest has bioluminescent or fluorescent reporter genes
L-glutamine	Thermofisher scientifc	25030081	None
Liquid nitrogen	British Oxygen Corporation	NA	Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments
Liquid nitrogen dewar, 5 litres	Thermo Fisher Scientific	TY509X1	Optional if cryopreserving tumor fragments
Matrigel® Matrix GFR, LDEV-Free, 5 ml	Corning Life Sciences	356230	Optional. Also available in 10 ml size (354230)
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002549	Pellet cells at 1200 rpm for 5-6 minutes
Mr. Frosty freezing containiner	Fisher Scientific	10110051	Optional if cryopreserving tumor fragments
NAIR Hair remover lotion/oil	Thermo Fisher Scientific	NC0132811	Can alternatively use an electric clipper with fine blade
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	None
Scalpel handle, #7 Short	Fine Science Tools, Inc.	10007-12	User preference as long as it accepts #15 scalpel blade
Small animal heated pad	VetTech	HE006	None
Stereomicroscope	GT Vision Ltd.	H600BV1	None
Sterile phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010023	Use for injections and also as part of the surgical scrub, alternating with chlorhexidine
Tissue adhesive (sterile)	3M Corporation	84-1469SB	Can alternatively use non-absorbable skin suture (6-0 size)
Trypan blue	Thermo Fisher Scientific	5250061	None
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25300054	Use 0.05%-0.25%
Tuberculin syringe (1 ml with 0.1 ml gradations)	Becton Dickinson	309659	Slip tip preferred over Luer
Vented tissue culture flasks, T-75	Corning Life Sciences	CLS3290	Can also use smaller or larger flasks, as needed