Fabricación de una nano-matriz biomimética con nanotubos base Janus y fibronectina para adherencia a células madre

Summary

El objetivo de este protocolo es mostrar el montaje de una nanomatrix biomimética (NM) con nanotubos base Janus (JBNT) y fibronectina (FN). Cuando se co-cultivan con células madre mesenquimales humanas (hMSCs), los NMs exhiben una excelente bioactividad en el fomento de la adhesión a los hMSCs.

Abstract

Un NM biomimético fue desarrollado para servir como un andamio biológico de ingeniería de tejidos, que puede mejorar el anclaje de las células madre. El NM biomimético se forma a partir de JBNT y FN a través del autoensamblaje en una solución acuosa. Los JBNT miden 200-300 μm de longitud con canales huecos hidrofóbicos internos y superficies hidrófilos externas. Los JBNT se cobran positivamente y los FNs se cobran negativamente. Por lo tanto, cuando se inyectan en una solución acuosa neutral, se unen a través de la unión novalente para formar los paquetes NM. El proceso de autoensamblaje se completa en pocos segundos sin ningún iniciador químico, fuente de calor o luz UV. Cuando el pH de la solución NM es menor que el punto isoeléctrico de los FN (pI 5.5-6.0), los paquetes NM se auto-liberarán debido a la presencia de FN cargado positivamente.

NM es conocido por imitar la matriz extracelular (ECM) morfológicamente y por lo tanto, se puede utilizar como un andamio inyectable, que proporciona una excelente plataforma para mejorar la adhesión hMSC. El análisis de densidad celular y los experimentos de imágenes de fluorescencia indicaron que los NMs aumentaron significativamente el anclaje de los hMSC en comparación con el control negativo.

Introduction

Las células madre mesenquimales humanas (hMSCs) han demostrado el potencial de autorretración y auto-diferenciación a lo largo de diferentes linajes mesenquimales, lo que ayuda en la regeneración y mantenimiento de los tejidos^1. Sobre la base del potencial de diferenciación, hMSCs se consideran como candidatos para lesiones de tejido mesenquimal y terapia de trastorno hematopoyético². hMSCs han demostrado la capacidad de promover la cicatrización de heridas mediante el aumento de la reparación de tejidos, la angiogénesis, y la reducción de la inflamación^3. Sin embargo, sin asistencia bioquímica o biomateriales, la eficiencia para que los hMSCs alcancen un tejido objetivo y funcionen en la ubicación deseada es baja^4. Aunque se han utilizado varios andamios de ingeniería para atraer hMSCs para adherirse a las lesiones, algunos sitios como la fractura de placas de crecimiento, en medio de un hueso largo, no son fácilmente accesibles por los andamios prefabricados convencionales, que pueden no caber perfectamente en un sitio lesionado de forma irregular.

Aquí, hemos desarrollado un nanomaterial biomimético que puede autoensamblarse in situ y ser inyectado a un área objetivo de difícil acceso. El nm bio-andamio inyectable se compone de nanotubos base Janus (JBNT) y fibronectina (FN). Los JBNT, también conocidos como los Rosette Nanotubes (RNTs), se derivan de pares de bases de ADN, específicamente timina y adenina, aquí^5,6,7. Como se ve en la Figura 1,los nanotubos se forman cuando seis moléculas de la base de ADN derivada se autoensamblan a través de enlaces de hidrógeno para formar un plano^6. Seis moléculas se apilan unas sobre otras en un plano a través de una fuerte interacción de pi-stacking^7,que puede ser de hasta 200-300 μm de longitud. Los JBNT están diseñados para imitar morfológicamente las fibras de colágeno para que el FN reaccione con ellas.

FN es una glicoproteína adhesiva de alto peso molecular, que se puede encontrar en la matriz extracelular (ECM)⁹. Estos pueden mediar el apego de las células madre a otros componentes del ECM, particularmente el colágeno^10. Diseñamos JBNT para imitar morfológicamente las fibras de colágeno para que FN pueda reaccionar con ellas para formar NM en pocos segundos a través de la unión no covalente. Por lo tanto, NM es un prometedor bio-andamio para ser inyectado en un sitio de fractura ósea que no podría ser accesible por los andamios fabricados convencionalmente. Aquí, el NM inyectable presenta una excelente capacidad para mejorar el anclaje hMSC in vitro, exhibiendo su potencial para servir como un andamio para la regeneración de tejidos.

Protocol

1. Síntesis de JBNT NOTA: El monómero JBNT se preparó como se publicó anteriormente11. Síntesis del compuesto A1 Preparar una solución que contenga 8,50 g de ácido cianoacético de 2 y 9,80 g de etilcarbamato en 25 ml de tolueno y 2,5 ml de N, N-dimetilformamida. Añadir 4,90 ml de cloruro de fósforo en sentido dropwise. A continuación, caliente la mezcla a 70 °C y siga revolviendo durante 1,5 h. Enfríe la mezcla de reacción a te…

Representative Results

Nuestros estudios descubrieron que la formación del NM de JBNT y FN es rápida, lo que sucedió en 10 segundos. Como se muestra en la Figura 2,floccule blanco se obtuvo cuando la solución JBNT se mezcló con la solución FN y se pipeted varias veces. El proceso de formación de NM es completamente biomimético. No se necesitan estímulos externos. El proceso de fabricación es mucho más fácil que el de algunos biomateriales emergentes, que se basa en la luz ultravioleta o iniciador quím…

Discussion

En este estudio, desarrollamos un NM biomimético autoensamblado, que se formó con JBNTs e FN inspirados en el ADN. Al preparar la solución JBNT, el polvo liofilizado JBNT debe disolverse en el agua en lugar de PBS porque PBS causará aglomeración de JBNT, lo que inhibe su montaje. Además, el NM también debe ensamblarse en agua si queremos observar las estructuras nano-fibril del NM, porque la sal en PBS se agrupará con fibras NM, lo que puede reducir en gran medida la resolución de las imágenes.

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Materials

1,2-dichloroethane	Alfa Aesar	39121
2-cyanoacetic acid	Sigma-Aldrich	C88505
4-Dimethylaminopyridine	TCI America	D1450
8 wells Chambered Coverglass	Thermo Fisher	155409
96-well plate	Corning	353072
absolute ethanol	Thermo Fisher	BP2818500
acetone	Sigma-Aldrich	179124
acetonitrile	Sigma-Aldrich	34851
allylamine	Sigma-Aldrich	145831
Basic Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC32G
citric acid	Sigma-Aldrich	251275
concentrated hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	H1758
Deionized water	Thermo Fisher	15230147
dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997
diethyl ether	Sigma-Aldrich	296082
Di-tert-butyl dicarbonate	Sigma-Aldrich	361941
ethyl acetate	Sigma-Aldrich	319902
ethylcarbamate	Sigma-Aldrich	U2500
Fibronectin	Thermo Fisher	PHE0023
Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS)	Thermo Fisher	R37814
guanidinium hydrochloride	Alfa Aesar	A13543
hexanes	Sigma-Aldrich	227064
Human mesenchymal stem cells	Lonza	PT-2501
methanol	Sigma-Aldrich	34860
methyl iodide	Sigma-Aldrich	289566
N,N-Diisopropylethylamine	Alfa Aesar	A17114
N,N-dimethylformamide	Sigma-Aldrich	227056
N-Methylmorpholine N-oxide	Alfa Aesar	A19802
Osmium tetraoxide	Alfa Aesar	45385
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140163
Phosphate Buffer Solution	Thermo Fisher	20012050
phosphoryl chloride	Sigma-Aldrich	201170
potassium carbonate	Sigma-Aldrich	347825
reverse phase column	Thermo Fisher	25305-154630
Rhodamine Phalloidin	Thermo Fisher	R415
silica gel	TCI America	S0821
sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
sodium ethoxide	Alfa Aesar	L13083
sodium periodide	Sigma-Aldrich	71859
sodium sulfate	Sigma-Aldrich	239313
sodium sulfite	Sigma-Aldrich	S0505
sodium triacetoxyborohydride	Alfa Aesar	B22060
spectrophotometer(NanoDrop One/Oneᶜ UV-Vis)	Thermo Fisher	ND-ONE-W
Stem Cell Growth Medium BulletKit	Lonza	PT-3001
tetrahydrofuran	Sigma-Aldrich	401757
thioanisole	Sigma-Aldrich	T28002
toluene	Sigma-Aldrich	179418
triethylamine	Alfa Aesar	A12646
trifluoroacetic acid	Alfa Aesar	A12198
Triton X-100	Thermo Fisher	HFH10
Trypsin-EDTA solution	Thermo Fisher	25200056