Fabrikasjon av en biomimetisk nanomatrise med Janus Base Nanorør og Fibronectin for stamcelleadhesjon

Summary

Målet med denne protokollen er å vise montering av en biomimetisk nanomatrix (NM) med Janus base nanorør (JBNTs) og fibronectin (FN). Når de er samkulturert med humane mesenchymale stamceller (hMSCer), viser NMs utmerket bioaktivitet i oppmuntrende hMSCer vedheft.

Abstract

En biomimetisk NM ble utviklet for å tjene som et vev-engineering biologisk stillas, som kan forbedre stamcelle forankring. Biomimetisk NM er dannet fra JBNTs og FN gjennom selvmontering i en vandig løsning. JBNTs måler 200-300 μm i lengde med indre hydrofobe hule kanaler og ytre hydrofile overflater. JBNTs belastes positivt og FNs belastes negativt. Derfor, når de injiseres i en nøytral vandig løsning, bindes de sammen via ikke-kovalent binding for å danne NM-buntene. Selvmonteringsprosessen fullføres i løpet av få sekunder uten kjemiske initiativtakere, varmekilde eller UV-lys. Når pH av NM-løsningen er lavere enn isoelektrisk punkt av FNs (pI 5.5-6.0), NM bunter vil selv-release på grunn av tilstedeværelsen av positivt ladet FN.

NM er kjent for å etterligne den ekstracellulære matrisen (ECM) morfologisk og dermed kan brukes som et injiserbart stillas, noe som gir en utmerket plattform for å forbedre hMSC vedheft. Celletetthetsanalyse og fluorescensavbildningseksperimenter indikerte at NMs økte ankerplassen til HMSCer betydelig sammenlignet med den negative kontrollen.

Introduction

Humane mesenchymale stamceller (hMSCer) har vist potensialet for selvfornyelse og selvdiensisjon langs forskjellige mesenchymale avstamninger, noe som bidrar til regenerering og vedlikehold av^{vev 1}. Basert på differensieringspotensialet, anses hMSCer som kandidater for mesenchymale vevsskader og hematopoetisk lidelsesterapi². hMSCs har vist evnen til å fremme sårheling ved å øke vevreparasjon, angiogenese og redusere betennelse³. Men uten biokjemisk eller biomaterialer assistanse, effektiviteten for hMSCs å nå et mål vev og funksjon på ønsket sted er lav⁴. Selv om ulike konstruerte stillas har blitt benyttet til å tiltrekke seg hMSCer for å holde seg på lesjonene, er noen steder som vekstplatebrudd, midt i et langt bein, ikke lett tilgjengelig av de konvensjonelle prefabrikkerte stillasene, som kanskje ikke passer perfekt inn i et uregelmessig formet skadet sted.

Her har vi utviklet et biomimetisk nanomateriale som selv kan montere in situ og injiseres til et vanskelig tilgjengelig målområde. Injiserbare bio-stillas NM består av Janus base nanorør (JBNTs) og fibronectin (FN). JBNTs, også kjent som Rosette Nanotubes (RNTs), er avledet fra DNA base par, spesielt thymine og adenin, her^5,6,7. Som vist i figur 1dannes nanorørene når seks molekyler av den avledede DNA-basen parer seg selv montere via hydrogenbindinger for å danne et plan⁶. Seks molekyler stables deretter på hverandre i et plan via en sterk pi-stabling interaksjon⁷, som kan være opp til 200-300 μm i lengde. JBNTs er designet for å morfologisk etterligne kollagenfibre slik at FN vil reagere med dem.

FN er et høymolekylært klebemiddel glykoprotein, som finnes i den ekstracellulære matrisen (ECM)⁹. Disse kan megle vedlegg av stamceller til andre komponenter i ECM, spesielt kollagen¹⁰. Vi designet JBNTs for å morfologisk etterligne kollagenfibre slik at FN kan reagere med dem for å danne NM om noen få sekunder via ikke-kovalent binding. Derfor er NM et lovende biostillas som skal injiseres i et beinbruddssted som ikke kunne være tilgjengelig av de konvensjonelt fabrikkerte stillasene. Her presenterer injiserbare NM en utmerket evne til å forbedre hMSC forankring in vitro, viser sitt potensial til å tjene som et stillas for vev regenerering.

Protocol

1. Syntese av JBNTs MERK: JBNT monomer ble utarbeidet som publisert tidligere11. Syntese av sammensattE A1 Forbered en oppløsning som inneholder 8,50 g 2-cyanoacetisk syre og 9,80 g etylkarbamat i 25 ml toluen og 2,5 ml N, N-dimetylformamid. Tilsett 4,90 ml fosforylkloriddråpevis. Varm deretter blandingen til 70 °C og fortsett å røre i 1,5 timer. Avkjøl reaksjonsblandingen til romtemperatur og hell i 100 g isvann. Trekk ut vandig lag m…

Representative Results

Våre studier oppdaget at dannelsen av NM av JBNTs og FN er rask, som skjedde i 10 sekunder. Som vist i figur 2ble hvit floccule oppnådd da JBNT-løsningen ble blandet med FN-løsningen og pipetted flere ganger. Dannelsesprosessen av NM er helt biomimetisk. Ingen ytre stimuli er nødvendig. Prosessen med fabrikasjon er mye enklere enn for noen nye biomaterialer, som er basert på ultrafiolett lys eller kjemisk initiativtaker for krysskobling13. <p class="jove_con…

Discussion

I denne studien utviklet vi en selvmontert biomimetisk NM, som ble dannet med DNA-inspirerte JBNTs og FN. Ved fremstilling av JBNT-løsningen skal JBNT lyofilisert pulver oppløses i vannet i stedet for PBS fordi PBS vil forårsake agglomerasjon av JBNTs, noe som hemmer deres montering. Videre bør NM også monteres i vann hvis vi ønsker å observere nano-fibril strukturer av NM, fordi saltet i PBS vil pakke med NM-fibre, noe som i stor grad kan redusere oppløsningen på bildene.

NM har vist…

Materials

1,2-dichloroethane	Alfa Aesar	39121
2-cyanoacetic acid	Sigma-Aldrich	C88505
4-Dimethylaminopyridine	TCI America	D1450
8 wells Chambered Coverglass	Thermo Fisher	155409
96-well plate	Corning	353072
absolute ethanol	Thermo Fisher	BP2818500
acetone	Sigma-Aldrich	179124
acetonitrile	Sigma-Aldrich	34851
allylamine	Sigma-Aldrich	145831
Basic Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC32G
citric acid	Sigma-Aldrich	251275
concentrated hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	H1758
Deionized water	Thermo Fisher	15230147
dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997
diethyl ether	Sigma-Aldrich	296082
Di-tert-butyl dicarbonate	Sigma-Aldrich	361941
ethyl acetate	Sigma-Aldrich	319902
ethylcarbamate	Sigma-Aldrich	U2500
Fibronectin	Thermo Fisher	PHE0023
Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS)	Thermo Fisher	R37814
guanidinium hydrochloride	Alfa Aesar	A13543
hexanes	Sigma-Aldrich	227064
Human mesenchymal stem cells	Lonza	PT-2501
methanol	Sigma-Aldrich	34860
methyl iodide	Sigma-Aldrich	289566
N,N-Diisopropylethylamine	Alfa Aesar	A17114
N,N-dimethylformamide	Sigma-Aldrich	227056
N-Methylmorpholine N-oxide	Alfa Aesar	A19802
Osmium tetraoxide	Alfa Aesar	45385
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140163
Phosphate Buffer Solution	Thermo Fisher	20012050
phosphoryl chloride	Sigma-Aldrich	201170
potassium carbonate	Sigma-Aldrich	347825
reverse phase column	Thermo Fisher	25305-154630
Rhodamine Phalloidin	Thermo Fisher	R415
silica gel	TCI America	S0821
sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
sodium ethoxide	Alfa Aesar	L13083
sodium periodide	Sigma-Aldrich	71859
sodium sulfate	Sigma-Aldrich	239313
sodium sulfite	Sigma-Aldrich	S0505
sodium triacetoxyborohydride	Alfa Aesar	B22060
spectrophotometer(NanoDrop One/Oneᶜ UV-Vis)	Thermo Fisher	ND-ONE-W
Stem Cell Growth Medium BulletKit	Lonza	PT-3001
tetrahydrofuran	Sigma-Aldrich	401757
thioanisole	Sigma-Aldrich	T28002
toluene	Sigma-Aldrich	179418
triethylamine	Alfa Aesar	A12646
trifluoroacetic acid	Alfa Aesar	A12198
Triton X-100	Thermo Fisher	HFH10
Trypsin-EDTA solution	Thermo Fisher	25200056