用Janus碱纳米管和纤维素制造用于干细胞粘附的仿生纳米矩阵

Summary

该协议的目的是展示与Janus碱纳米管（JBNTs）和纤维素（FN）的生物仿生纳米三角星（NM）的组装。当与人类间质干细胞 （hMSC） 共同培养时，NMs 在鼓励 hMSC 粘附方面表现出出色的生物活性。

Abstract

一种仿生NM被开发为组织工程生物脚手架，可以增强干细胞锚定。生物仿生NM由JBNT和FN通过水溶液中的自组装而形成。JBNT 的长度为 200-300μm，内有疏水空心通道和外部亲水表面。JBNT 带正电荷，FN 收取负费用。因此，当注入中性液态溶液时，它们通过非价粘合粘合在一起，形成 NM 束。自组装过程在几秒钟内完成，没有任何化学启动器、热源或紫外线。当 NM 解决方案的 pH 度低于 FN 的等电点（pI 5.5-6.0）时，NM 捆绑包将由于带正电荷 FN 的存在而自行释放。

众所周知，NM 在形态上模仿细胞外矩阵 （ECM），因此可以用作注射脚手架，这为增强 hMSC 粘附性提供了绝佳的平台。细胞密度分析和荧光成像实验表明，与负控制相比，NMS显著增加了 hMSC 的锚定。

Introduction

人类间质干细胞（hMSCs）已经显示出沿着不同的间质血统自我更新和自我分化的潜力，这有助于组织¹的再生和维持。基于分化潜力，hMSC被认为是间质组织损伤和造血障碍治疗²的候选者。hMSC已经显示出通过增加组织修复，血管生成和减少炎症³促进伤口愈合的能力。然而，如果没有生化或生物材料的帮助，hMSC在预期位置达到目标组织和功能的效率很低^。虽然各种工程脚手架已被利用来吸引 hMSC 粘附在病变上，但一些部位（如长骨中间的生长板断裂）不容易被传统的预制脚手架使用，这些脚手架可能无法完全适应不规则形状的受伤部位。

在这里，我们开发了一种生物仿生纳米材料，可以就地自组装，并注射到难以到达的目标区域。注射生物脚手架NM由Janus基纳米管（JBNTs）和纤维素（FN）组成。JBNTs，也被称为罗塞特纳米管（RNTs），来自DNA碱基对，特别是胸腺素和腺苷，这里^5，6，7。如图1所见，纳米管形成时，六个分子的衍生DNA碱基对自组装通过氢键形成平面^6。然后，六个分子通过强大的 pi 堆叠相互作用⁷在平面上相互堆叠，长度可达 200-300μm。JBNT 旨在从形态上模仿胶原纤维，以便 FN 能够对它们做出反应。

FN是一种高分子量的胶粘剂糖蛋白，可以在细胞外基质^（ECM）9中找到。这些可以调解干细胞附着在ECM的其他成分，特别是胶原蛋白^10。我们设计了 JBNT 来形态模仿胶原纤维，以便 FN 能够在几秒钟内通过非价粘接与它们做出反应，形成 NM。因此，NM 是一个有希望的生物脚手架，可注射到传统制造的脚手架无法到达的骨折部位。在这里，注射NM提供了一个极好的能力，以提高hMSC锚定体外，显示其潜力，作为组织再生的脚手架。

Protocol

1. JBNT的合成 注：JBNT单体是如前11年出版的。 化合物A1的合成 在 25 mL 甲苯和 2.5 mL N、二甲基甲酰胺中准备含有 8.50 克 2 氰乙酸和 9.80 克乙基碳酸的溶液。向下添加 4.90 mL 氯化磷。然后将混合物加热至70°C，并保持搅拌1.5小时。 冷却反应混合物到室温，倒入100克冰水。用乙酸乙酸乙酯（3 x 250 mL）提取水层，用100mL盐水清洗。将有机层干燥…

Representative Results

我们的研究发现，JBNT和FN的NM形成速度很快，在10秒内发生。如图2所示，当JBNT溶液与FN溶液混合并多次吹笛时，获得白色絮凝。NM的形成过程完全是生物仿生。无需外部刺激。制造过程比一些新兴生物材料容易得多，这些生物材料基于紫外线或化学启动器，用于交叉链接13。 我们捕获并分析了 FN、JBNT 和 NM（图 3）?…

Discussion

在这项研究中，我们开发了一种自组装的仿生NM，它是由DNA启发的JBNT和FN形成的。在准备 JBNT 解决方案时，JBNT 亲血粉应该溶解到水中，而不是 PBS 中，因为 PBS 会导致 JBNT 的聚集，从而抑制其组装。此外，如果我们想要观察NM的纳米纤维结构，NM也应该在水中组装，因为PBS中的盐会与NM纤维捆绑在一起，从而大大降低图像的分辨率。

NM已显示出巨大的潜力，作为一个新的组织工?…

Materials

1,2-dichloroethane	Alfa Aesar	39121
2-cyanoacetic acid	Sigma-Aldrich	C88505
4-Dimethylaminopyridine	TCI America	D1450
8 wells Chambered Coverglass	Thermo Fisher	155409
96-well plate	Corning	353072
absolute ethanol	Thermo Fisher	BP2818500
acetone	Sigma-Aldrich	179124
acetonitrile	Sigma-Aldrich	34851
allylamine	Sigma-Aldrich	145831
Basic Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC32G
citric acid	Sigma-Aldrich	251275
concentrated hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	H1758
Deionized water	Thermo Fisher	15230147
dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997
diethyl ether	Sigma-Aldrich	296082
Di-tert-butyl dicarbonate	Sigma-Aldrich	361941
ethyl acetate	Sigma-Aldrich	319902
ethylcarbamate	Sigma-Aldrich	U2500
Fibronectin	Thermo Fisher	PHE0023
Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS)	Thermo Fisher	R37814
guanidinium hydrochloride	Alfa Aesar	A13543
hexanes	Sigma-Aldrich	227064
Human mesenchymal stem cells	Lonza	PT-2501
methanol	Sigma-Aldrich	34860
methyl iodide	Sigma-Aldrich	289566
N,N-Diisopropylethylamine	Alfa Aesar	A17114
N,N-dimethylformamide	Sigma-Aldrich	227056
N-Methylmorpholine N-oxide	Alfa Aesar	A19802
Osmium tetraoxide	Alfa Aesar	45385
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140163
Phosphate Buffer Solution	Thermo Fisher	20012050
phosphoryl chloride	Sigma-Aldrich	201170
potassium carbonate	Sigma-Aldrich	347825
reverse phase column	Thermo Fisher	25305-154630
Rhodamine Phalloidin	Thermo Fisher	R415
silica gel	TCI America	S0821
sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
sodium ethoxide	Alfa Aesar	L13083
sodium periodide	Sigma-Aldrich	71859
sodium sulfate	Sigma-Aldrich	239313
sodium sulfite	Sigma-Aldrich	S0505
sodium triacetoxyborohydride	Alfa Aesar	B22060
spectrophotometer(NanoDrop One/Oneᶜ UV-Vis)	Thermo Fisher	ND-ONE-W
Stem Cell Growth Medium BulletKit	Lonza	PT-3001
tetrahydrofuran	Sigma-Aldrich	401757
thioanisole	Sigma-Aldrich	T28002
toluene	Sigma-Aldrich	179418
triethylamine	Alfa Aesar	A12646
trifluoroacetic acid	Alfa Aesar	A12198
Triton X-100	Thermo Fisher	HFH10
Trypsin-EDTA solution	Thermo Fisher	25200056