Burada 3D kültür koşullarında domuz oositkapsülasyonu için iki protokol sunulmuştur. İlk olarak, kümülüs-oosit kompleksleri (COCs) fibrin-aljinat boncuklar kapsüllenir. İkincisi, florlu etilen propilen toz parçacıkları (mikrobiyoreaktörler) ile çevrilidir. Her iki sistem de 3B organizasyonlarını sürdürmek için en uygun koşulları sağlar.
Üreme biyolojisinde, suni döllenme ve embriyo transfer teknolojisi ile başlayan biyoteknoloji devrimi, yumurta tüp bebek olgunlaşma (IVM), tüp bebek (IVF) ve somatik hücreden nükleer transfer ile evcil hayvanların klonlanması gibi yardımcı üreme tekniklerinin geliştirilmesine yol açmıştır. IVM özellikle önem eger bir yöntemdir. Ticari olarak önemli veya nesli tükenmekte olan türlerde üretim aralığının azaltılması, in vitro insan üremesi ile ilgili araştırmalar ve hücre tedavileri için transgenik hayvanların üretimi gibi uygulamalar için olgun, kaliteli oositlerin tedariki için platform teknolojisidir. Yumurta kalitesi terimi olgunlaşmayı tamamlama, döllenme ve sağlıklı yavrular olma yetkinliğini içerir. Bu iyi kalitede oositler IVF prosedürleri de dahil olmak üzere başarılı döllenme için her şeyden önemli olduğu anlamına gelir. Bu, sadece insan yumurtalarının değil, diğer büyük memeli türlerinin de büyümesini destekleyecek güvenilir bir kültür yöntemi geliştirmekte birçok zorluk teşkil eder. IVM’de ilk adım yumurtaların in vitro kültürüdür. Bu çalışma, domuz yumurtası 3D kültür için iki protokol açıklar. İlk olarak, 3D model kümülüs kompleksleri (COCs) bir fibrin-aljinat boncuk interpenetrating ağ kapsüllenir, hangi fibrin ve aljinat karışımı aynı anda jellenir. İkincisinde, COC’lar bir damla orta alanda askıya alınır ve sıvı mermerler (LM) olarak tanımlanan mikrobiyoreaktörleri oluşturmak için florürlü propilen (FEP; heksofloropropilen ve tetrafloroetilen kopolimeri) ile kapsüllenirler. Her iki 3D sistem de gaz tüp bebek kültür ortamını korur. Ayrıca, boşluk kavşaklarının düzlemesini ve bunun sonucu olarak bozulmalarını önleyerek, yumurta ve çevresindeki foliküler hücreler arasındaki işlevsel ilişkiyi koruyarak COCs 3D organizasyonunu sürdürürler.
Üç boyutlu (3D) olanlar da dahil olmak üzere çeşitli kültür sistemlerinin geliştirilmesi, gelişimin en erken aşamalarında bile foliküllerden izole edilen yumurtaların büyümesi ve olgunlaşması için en uygun koşulları sağlamayı amaçlamaktadır. Bu yardımlı üreme teknikleri için büyük önem taşımaktadır (ART), özellikle kanser tedavisi sonrası kısırlık ile mücadele eden kadınların artan sayıda görünümünde1. In vitro koşullarda yumurtaların olgunlaşması (IVM) zaten hayvancılık üreme amacıyla in vitro embriyo üretimi için kullanılan iyi kurulmuş bir tekniktir2. Ancak, çoğu memeli türünde, kümülüs-oosit komplekslerinin (COC) yüksek olgunlaşma oranları elde edilebilse bile (dağılım %60-90)3,gelişimsel yeterlilikleri hala ihtiyaçlara yetersizdir. Bunun nedeni blastosist evresine kadar bile böyle bir şekilde elde edilen zigotların gelişiminin düşük olması ve vekil hayvanlara aktarılmasından sonra dönemsel canlılıklarının azalmasıdır. Sonuç olarak, IVM prosedürüne tabi tutulan yumurtalardan elde edilen embriyoların gelişimsel yeterliliğinin arttırılması gerekmektedir4. Bu nedenle, yeni olgunlaşma medya5 ve in vitro kültürün çeşitli dönemlerde test edilmektedir6,7 çeşitli büyüme faktörleri ve molekülleri ile kültür medya takviyesi ile birlikte8,9.
Herhangi bir komple IVM sisteminin ilk adımı in vitro kültür sırasında yumurtasürdürülebilir büyüme için en uygun koşulları oluşturmaktır. Oosit büyümesi, yumurtanın10,11numaralı mayaya devam etme yeteneğinin belirli göstergelerinden biridir. Buna ek olarak, uygun bir oosit in vitro kültür sistemi nükleer olgunlaşma ve sitoplazmik farklılaşma12destekleyen yeteneğine sahip olmalıdır. Kümülüs-oosit kompleksinin morfolojisi, insan ve hayvanda in vitro fertilizasyon (IVF) prosedürünün sonraki adımları için en iyi yumurtayı seçmek için ART kliniklerinde kullanılan bir diğer önemli göstergedir12,13. Düşünülen COC’ların morfolojik özellikleri arasında: yumurta çapı, sitoplazma granülasyonu ve ilk polar vücut bütünlüğü14,15. Ayrıca, yumurta gelişim potansiyeli kümülüs hücrelerinin görünümü ve sıkıştırma ve yumurta çevreleyen tabakalarının sayısı ile ilişkilidir. Çok uygun oosit in vitro kültür sistemi için önemli de oosit-kümülüs hücrelerinin uygun etkileşimleri ve sitoiskelet istikrar16,17,,18,19bakım . Şimdiye kadar, insan COCs içinde in vitro oosit büyümegösterilmiştir 20. İnek COC’lerinin kullanımı da canlı doğumlarla sonuçlandı. Bu olgunlaşmamış yumurtalık folikülleri izole edildi ve daha sonra 14 gün boyunca kültüre kadar oosit ivf prosedürü21geçmesi için yeterince büyüktü . Benzer şekilde, in vitro kültür den sonra IVM tabi babun antral folikülleri izole COCs normal görünen iğ yapısı ile metafaz II aşamasına mayiosis reinitiating yeteneğine sahip oositler verdi22. Ancak bu çalışmada yazarlar onları döllemeye çalışmadı. Yine de bu tür sonuçlar, benzer bir prosedürün sadece bu memeli türlerine değil, aynı zamanda foliküllerden elde edilen insan kümülüs-oosit komplekslerine de uygulanabileceğini göstermektedir.
Yukarıda açıklanan sonuçlar, yumurtaların iki boyutlu (2D) sistemlerde kültürlendiği konvansiyonel IVM protokollerinin uygulanması ile elde edilmiştir. 2D kültür sistemlerinde rutin prosedür, uygun bir kültür ortamının bir damla batırılmış, mineral yağ23,,24ile oositler kapsayan . Bu in vitro oosit kültürü sırasında bir yağ bindirme sıvı buharlaşmayı önlemek için hizmet, böylece kültürde uygun pH ve ozmotik basınç bakımı sağlanması kabul edilir. Böyle bir 2D kültür sistemi elde etmek için izin rağmen, olgun domuz oositlerin bile% 87 kadar25, bu mineral yağ bindirme uygun yumurta gelişimi için gerekli olan lipid çözünür malzemelerin önemli difüzyon neden olduğu kanıtlanmıştır26. Ayrıca, yumurta kültürü sırasında mineral yağiçine steroidler (progesteron ve östrojenler) difüzyon nedeniyle, nükleer olgunlaşma bir gecikme ve domuz yumurtalarının gelişimsel yeterlilik başarı azalma gözlenmiştir. Bu zigotaz sayıda elde neden olabilir, ayrıca blastosist aşamasına düşük gelişim kapasitesi ile karakterizedir ve alıcı hayvanlara aktarılan sonra kötü canlılık ile27. Bu nedenle, IVM prosedürü nden sonra alınan yumurtalardan elde edilen embriyoların gelişimsel yeterliliğini artırmak için, özellikle üç boyutlu (3D) sistemler kullanılarak, kompleks olarak C’lerle birlikte kültüre sahip yumurtaların hem sitoplazmik hem de nükleer olgunluğa ulaşması için en uygun koşulları yaratarak girişimler yapılmaktadır. Çeşitli yenilikçi 3D in vitro kültür sistemleri son yirmi yılda28,,29geliştirilmiştir. Bunlar, hücrelerin doğal uzamsal organizasyonunu sürdürmek ve geleneksel 2B kültürlerde elde edilemeyen kültür yemeklerinde düzleştirmelerini önlemek için tasarlanmıştır. Kültürlü COC’ların yapısal ve işlevsel aktivitesi, uygun mimarilerinin sürdürülmesi ve çeşitli bölmeler arasındaki boşluk kavşakları aracılığıyla kesintisiz iletişim ile sağlanabilir30. Kümülüs-oosit komplekslerinin 3D in vitro kültürü için biyo-iskelelerin uygunluğu ekstra-hücre dışı matriks (ECM; kollajen ve hyaluronik asit)31 veya inert polimerler (aljinat)32gibi doğal biyomalzemeler kullanılarak değerlendirilmiştir. Çeşitli türlerde test edilen bu girişimler, yumurta lı kekozisin yeniden başlaması ve tam yeterliliklerinin elde edilmesini açısından umut verici sonuçlar almıştır33,34,35. Ancak şimdiye kadar, domuzlar da dahil olmak üzere büyük evcil hayvanlardan izole COCs olgunlaşma için uygun hiçbir 3D sistem geliştirilmiştir.
Bu çalışma, domuz COCs 3D kültür için kullanılabilecek iki protokolleri açıklar. İlk protokol de fibrin-aljinat boncuklarda (FAB) kapsülleme tanımlanır. FAB eşzamanlı bir aljinat ve fibrin çözeltisi karıştırma tarafından oluşturulabilir, hangi bir senkron jelleşme sürecinden geçmesi. Her iki bileşen de matris sertliğine katkıda bulununca, bu kombinasyon dinamik bir mekanik ortam sağlar. Benzer bir çözüm daha önce fare yumurtalık folikül kültürü ve olgunlaşma36için kullanılmıştır. Sunulan protokolde, aljinat-fibrin ağının erken bozulmasını önlemek için, hızlı ve istikrarlı bir jelleşme süreci sağlayarak uygun şekilde daha yüksek kalsiyum klorür çözeltisi konsantrasyonları kullanılır. Dinamik mekanik ortam, COC’lerin bulunduğu ve boyutlarının arttığı doğal foliküler ortamda buna benzer koşullar yaratır. Buna ek olarak, çalışma, mikrobiyoreaktörler (Sıvı Mermerler, LM) oluşturmak için, ortam bir damla askıya alınan ve florlu etilen propilen (FEP; heksofloropropilen ve tetrafloroetilen kopolimer) toz parçacıkları ile kapsüllenmiş cocs 3D kültür sistemlerinin temsili sonuçlarını göstermektedir. LM daha önce destek gösterilmiştir 3D biyoreaktör bir formudur, diğerleri arasında, yaşayan mikroorganizmaların büyüme37, tümör sferoidler38 ve embriyonik kök hücreler39. LMs de başarıyla koyun yumurta kültürü40için kullanılmıştır. LM’ler kullanılarak yapılan deneylerin çoğunda biyoreaktörler 1 μm41partikül boyutuna sahip politetrafloroetilen (PTFE) toz yatağı kullanılarak hazırlanmıştır. Sunulan protokol, floropolimerler PTFE’ye kompozisyon ve özellikleri çok benzer olan FEP’i kullanır. Ama FEP ptfe daha kolay biçimlenebilir ve yumuşak ve ne özellikle önemlidir, son derece şeffaftır.
Her iki 3D sistem de gaz tüp bebek kültür ortamını korur. Ayrıca, oosit ve çevresindeki foliküler hücreler arasındaki işlevsel ilişkiyi koruyarak, boşluk kavşaklarının düzlemesini ve bunun sonucu olarak bozulmasını önleyerek COCs 3D organizasyonunu sürdürürler.
Sadece yumurtanın değil, onu çevreleyen kümülüs hücrelerinin de tüp bebek büyümesini sürdürebilme ve aynı zamanda olgunlaşmasını destekleyebilme yeteneği, başarılı yardımcı üreme teknolojileri için ve özellikle insan veya domuz gibi uzun süreli foliküler büyüme uygulanan türlerde somatik hücre/oosit etkileşimlerinin anlaşılmasını ilerletmek için son derece önemlidir. Sürekli geliştirilmiş IVM teknikleri polikistik over sendromu (PCOS), erken yumurtalık yetmezliği veya kesin kıs…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar çok müteşekkir: dr Waclaw Tworzydlo (Gelişimbiyoloji ve Omurgasız Morfoloji Bölümü, Zooloji ve Biyomedikal Araştırma Enstitüsü, Jagiellonian Üniversitesi) TEM teknik tesisleri için; Teknik yardım için Bayan Beata Snakowska’ya (Endokrinoloji Anabilim Dalı, Zooloji ve Biyomedikal Araştırma Enstitüsü, Jagiellonian Üniversitesi); Hücre Biyolojisi ve Görüntüleme Bölümü, Zooloji ve Biyomedikal Araştırma Enstitüsü, Jagiellonian Üniversitesi, JEOL JEM 2100HT (JEOL, Tokyo, Japonya). Bu çalışma Polonya Ulusal Bilim Merkezi’nin 2018/29/N/NZ9/00983 sayılı hibe ile desteklenmiştir.
General | |||
Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml | Thermo Fisher | 15240062 | 2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2) |
DMEM/F12 (500ml) | Sigma-Aldrich | D8062 | Handling and Maturation Medium |
DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml | Thermo Fisher | 14190144 | |
FCS (100 ml) | Thermo Fisher | 16140063 | 10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.) |
PBS (1x, pH 7.4) 500ml | Thermo Fisher | 10010023 | |
TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml | Cayman Chemicals | 600232 | 1x final concentration. Other brand can be use |
Maturation Medium | |||
hCG (1 VIAL of 10 000 U) | Sigma-Aldrich | CG10 | |
PMSG | BioVendor | RP1782721000 | |
Fibrin-alginate beads | |||
Alginate Lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | (Step 2.11.1) |
Thrombin | Sigma-Aldrich | T9326-150UN | (Step 2.1) |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | (Step 2.1) |
Fibrinogen (250mg) | Sigma-Aldrich | F3879 | (Step 2.2) |
Sodium Alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | (Step 2.3) use for alginate solution |
Liquid Marble | |||
FEP | Dyneon GmbH 3M AdMD | A-66670 | |
Morphological examination | |||
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher | L3224 | (Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm – EthD-1 |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium |
Ultrastructure examination | |||
Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G5882 | 2.5% final concentraion (Step 4.2.1.) |
LR White resin | Sigma-Aldrich | L9774 | (Step 4.2.4.) |
Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | (Step 4.2.5.) |
Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | O5500 | (Step 4.2.3.) |
Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | C0250 | Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2) |
Uranyl Acetate | POCH | 868540111 | (Step 4.2.4.) |
Specific instruments, tools | |||
30 mm Pteri dish | TPP | 93040 | |
60 mm IVF Petri dish | Falcon | 353653 | |
Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor | RI Life Sciences | 8-72-288 | |
Ez-Tip | RI Life Sciences | 8-72-4155/20 | |
Heating Table | SEMIC | Other brands can be used | |
Incubator | Panasonic | MCO-170AIC-PE | Other brands can be used |
Sterile petri dish (10 cm) | NEST Biotechnology | 704002 | |
Sterile syringe filters with 0.2 µm | GOOGLAB SCIENTIFIC | GB-30-022PES | |
Thermos | Quechua | 5602589 | Other brands can be used |