Proteolytisk nedbrudt alginathydrgels og hydrofobe mikrobioreaktorer til Porcine Oocyt Indkapsling

Summary

Præsenteret her er to protokoller for indkapsling af svin oocytter i 3D-kultur betingelser. I den første er cumulus-oocyt komplekser (P-piller) indkapslet i fibrin-alginat perler. I den anden, de er omgivet af fluorerede ethylen propylen pulverpartikler (mikrobioreaktorer). Begge systemer sikrer optimale betingelser for at opretholde deres 3D-organisation.

Abstract

Inden for reproduktiv biologi førte den bioteknologiske revolution, der begyndte med kunstig befrugtning og embryooverførselsteknologi, til udvikling af assisterede reproduktionsteknikker såsom oocyt in vitromodning (IVM), in vitro-befrugtning (IVF) og kloning af husdyr ved nuklear overførsel fra somatiske celler. IVM er den metode, der er særlig vigtig. Det er platformteknologien til levering af modne oocytter af god kvalitet til anvendelser såsom reduktion af produktionsintervallet i kommercielt vigtige eller truede arter, forskning i in vitro-menneskelig reproduktion og produktion af transgene dyr til cellebehandlinger. Udtrykket oocyt kvalitet omfatter sin kompetence til at fuldføre modning, befrugtes, og dermed resulterer i sunde afkom. Det betyder, at oocytter af god kvalitet er altafgørende for vellykket befrugtning, herunder IVF procedurer. Dette giver mange vanskeligheder med at udvikle en pålidelig kulturmetode, der vil understøtte væksten ikke kun af menneskelige oocytter, men også af andre store pattedyrarter. Det første skridt i IVM er in vitro kultur oocytter. Dette værk beskriver to protokoller for 3D-kulturen af svin oocytter. I den første er 3D-model cumulus-oocyt komplekser (COC’er) indkapslet i en fibrin-alginat perle interpenetrating netværk, hvor en blanding af fibrin og alginat er geleret samtidigt. I den anden suspenderes p-piller i en dråbe medium og indkapslet med fluorholdige ethylenprokylen (FEP; en copolymer af hexafluoropropylen og tetrafluorethylen) pulverpartikler til mikrobioreaktorer defineret som flydende kugler (LM). Begge 3D-systemer opretholder det gasformige in vitro-kulturmiljø. De opretholder også COCs 3D-organisationen ved at forhindre, at de udfladning og deraf følgende afbrydelse af mellemrumskryds bevares, hvorved det funktionelle forhold mellem oocyt og de omkringliggende follikulære celler bevares.

Introduction

Udviklingen af forskellige kultursystemer, herunder tredimensionelle (3D) dem, har til formål at give optimale betingelser for vækst og modning af oocytter isoleret fra folliklerne selv i de tidligste stadier af udviklingen. Dette er af stor betydning for assisterede reproduktive teknikker (ART), især i betragtning af det stigende antal kvinder, der kæmper med barnløshed efter kræftbehandling¹. Modning af oocytter under in vitro-forhold (IVM) er allerede en veletableret teknik, der hovedsagelig anvendes til in vitro embryo produktion med henblik på husdyrreproduktion². I de fleste pattedyrsarter kan der imidlertid opnås en høj modning af cumulus-oocytkomplekser (COC) (interval 60-90 %)³, men deres udviklingskompetence er stadig utilstrækkelig i forhold til behovene. Dette skyldes, at udviklingen af zygotes opnået på en sådan måde, selv op til blastocyst fase er lav, og efter overførslen til surrogat dyr deres levedygtighed til sigt er reduceret. Der er derfor behov for at øge udviklingskompetencen for embryoner fra oocytter, der blev underkastet IVM-proceduren⁴. Derfor er nye modning medier⁵ ved at blive udtænkt og forskellige perioder med in vitro kultur er^{testet 6,7} sammen med tilskud af kultur medier med forskellige vækstfaktorer og^{molekyler 8,9}.

Det første skridt i ethvert komplet IVM-system er at skabe optimale betingelser for bæredygtig vækst af oocytter under in vitro-kultur. Den oocyte vækst er en af de specifikke indikatorer for oocyt evne til at genoptage meiose^10,11. Desuden skal et passende oocyt in vitro-kultursystem kunne understøtte dets nukleare modning og cytoplasmatisk differentiering¹². Morfologien af cumulus-oocyt kompleks er en anden vigtig indikator, der anvendes i ART klinikker til at vælge den bedste oocyt for efterfølgende trin i in vitro befrugtning (IVF) procedure hos mennesker og husdyr^12,13. Blandt de morfologiske egenskaber ved de behandlede p-pc’er er: oocytdiameteren, dens cytoplasmagranulation og den første polarkropintegritet^14,15. Udover, oocyte udviklingspotentiale er korreleret med udseende og komprimering af cumulus celler og antallet af deres lag omkring oocyt. Meget vigtigt for passende oocyt in vitro kultur system er også vedligeholdelse af oocyt-cumulus celler korrekt interaktioner og cytoskeleton stabilitet^16,17,18,19. Hidtil har in vitro oocyt vækst inden for menneskelige p-piller blevet påvist²⁰. Brugen af ko-p-piller resulterede også i levendefødte. Disse blev isoleret fra umodne æggestokkene follikler og derefter dyrket i 14 dage, indtil oocyt var tilstrækkelig stor til at gennemgå IVF procedure²¹. Tilsvarende p-piller isoleret fra bavian antral follikler, udsat for IVM efter in vitro kultur gav oocytter stand til at reinitiere meiose til metafase II fase med en normal vises spindel struktur²². Men i denne undersøgelse forfatterne ikke forsøge at befrugte dem. Ikke desto mindre tyder sådanne resultater på, at en lignende procedure ikke kun kan anvendes på disse særlige pattedyrarter, men også på humane cumulus-oocytkomplekser, der er fremstillet af follikler, hvad der bør gøre det muligt at opnå oocytter af god kvalitet, der er egnet til en vellykket IVF-teknik.

De ovenfor beskrevne resultater blev opnået ved anvendelse af konventionelle IVM-protokoller, hvor oocytter blev dyrket i todimensionale (2D) systemer. Den rutinemæssige procedure i 2D-kultursystemer dækker oocytter, nedsænket i en dråbe af en passende kultur medier, med mineralsk olie^23,24. Det antages, at en olieoverlejring under in vitro oocyt kultur tjener til at forhindre flydende fordampning, og dermed sikre opretholdelsen af korrekt pH og osmotisk tryk i kulturen. Selv om et sådant 2D-kultursystem gør det muligt at opnå, selv op til 87% af modne gris oocytter²⁵, er det blevet bevist, at mineralolie overlay forårsager betydelig diffusion af lipidopløselige materialer, som er nødvendige for korrekt oocytter udvikling²⁶. Derudover, på grund af steroider (progesteron og østrogener) diffusion i mineralolie under oocyt kultur, en forsinkelse af nuklear modning og reduktion i udviklingsmæssige kompetence opnåelse af svin oocytter blev observeret. Dette kan resultere i, at der opnås et lille antal zygotes, som desuden er kendetegnet ved lav udviklingskapacitet til blastocyst-fasen og af dårlig levedygtighed efter overførsel til recipientdyr²⁷. Der gøres derfor forsøg på at øge udviklingskompetencen hos embryoner, der stammer fra oocytter, der modtages efter IVM-proceduren, ved at skabe optimale betingelser for at opnå både cytoplasmatisk og nuklear modenhed af oocytter, der dyrkes sammen med CC’er som komplekser, især ved hjælp af tredimensionale (3D) systemer. Der er i de sidste to årtier udviklet forskellige innovative 3D in vitro-kultursystemer^28,29. Disse var designet til at opretholde den naturlige rumlige organisering af celler og for at undgå deres udfladning i kulturretter, hvad der ikke kan opnås i de traditionelle 2D-kulturer. De dyrkede p-pillers strukturelle og funktionelle aktivitet kan sikres ved at opretholde deres korrekte arkitektur og uforstyrret kommunikation gennem mellemrumskryds mellem forskellige^{rum 30}. Egnetheden af bio-stilladser til 3D in vitro kultur cumulus-oocyt komplekser er blevet evalueret ved hjælp af naturlige biomaterialer såsom forskellige komponenter i den ekstra-cellulære matrix (ECM; kollagen og hyaluronsyre)³¹ eller inaktive polymerer (alginat)³². Disse forsøg, der blev testet i flere arter , gav lovende resultater med hensyn til genoptagelse af meiose oocyt meiose og opnåelse af deres fulde^{kompetence 33,34,35}. Indtil videre er der imidlertid ikke udviklet noget 3D-system, der er egnet til modning af p-piller, der er isoleret fra store husdyr, herunder svin.

Dette arbejde beskriver to protokoller, der kan bruges til 3D-kulturen i svine-p-piller. Den første protokol beskriver indkapsling i fibrin-alginat perler (FAB). FAB kan dannes ved samtidig blanding af en alginat- og fibrinopløsning, som gennemgår en synkron geleringsproces. Denne kombination giver et dynamisk mekanisk miljø, fordi begge komponenter bidrager til matrix stivhed. En lignende opløsning har tidligere været anvendt til mus ovariesækken kultur og modning³⁶. For så vidt angår den præsenterede protokol anvendes passende højere koncentrationer af calciumchloridopløsning for at undgå for tidlig nedbrydning af alginat-fibrinnettet, hvilket sikrer en hurtig og stabil geleringsproces. Det dynamiske mekaniske miljø skaber betingelser svarende til disse i det naturlige intrasækkulære miljø, hvor p-piller bor og øger størrelsen. Derudover viser arbejdet repræsentative resultater af COCs 3D-kultursystemer, hvor disse er suspenderet i en dråbe medium og indkapslet med fluorholdige ethylen propylen (FEP; en copolymer af hexafluoropropylen og tetrafluorethylen) pulverpartikler, til at danne mikrobioreaktorer (Flydende kugler, LM). LM er en form for 3D bioreaktor, der tidligere har vist sig at støtte, blandt andre, vækst af levende mikroorganismer³⁷, tumor sfæroider³⁸ og embryonale stamceller³⁹. LMs er også med succes blevet brugt til får oocyt kultur⁴⁰. I de fleste forsøg med FLYDENDE blev bioreaktorer fremstillet ved hjælp af polytetrafluorethylen (PTFE) pulverseng med partikelstørrelse på 1 μm⁴¹. Den præsenterede protokol bruger FEP, som er meget ens i sammensætning og egenskaber til fluorpolymerer PTFE. Men FEP er lettere formbar og blødere end PTFE, og hvad der er særligt vigtigt, det er meget gennemsigtig.

Begge 3D-systemer opretholder det gasformige in vitro-kulturmiljø. De opretholder også COCs 3D-organisationen ved at forhindre deres udfladning og deraf følgende afbrydelse af mellemrumskryds, bevare deres funktionelle forhold mellem oocyt og de omkringliggende follikulære celler.

Protocol

Følgende procedurer blev godkendt af Dyrevelfærdsudvalget ved Institut for Zoologi og Biomedicinsk Forskning ved Jagiellonian University. 1. Isolering af porcine cumulus-oocyt komplekser At indsamle materiale til isolering af ovariefoske, punktøre æggestokke fra præpubertale gylte (ca. 6-7 måneder, vejer 70 til 80 kg) på et lokalt slagteri. Vælg ca. 20 svine æggestokke fra 10 dyr til COCs isolation i hvert forsøg.BEMÆRK: Hvis man antager, at hver æggesting giver 3-5 f…

Representative Results

I p-piller, der anvender begge IVM-systemer, holdt granulosacellerne sig tæt til hinanden, og de fleste af de genvundne p-piller havde intakte lag af cumulusceller (Figur 1A, B). Desuden blev en betydelig del af cumulusceller bevaret. Resultaterne af cocs levedygtighedsanalysen bekræftede, at begge systemer, der anvendes til indkapsling af porcine oocytter i 3D in vitro-forhold, sikrede optimale vækstbetingelser (figur 2</s…

Discussion

Evnen til at opretholde in vitro vækst ikke kun af oocyt, men også af cumulus celler omkring det og samtidig støtte dens modning er yderst afgørende for den vellykkede assisteret reproduktive teknologier og for at fremme forståelsen af somatiske celle / oocyt interaktioner især hos arter, der gennemgår langvarig follikulær vækst såsom mennesker eller svin. Løbende forbedrede IVM teknikker bliver nyttigt redskab til at bevare reproduktive muligheder i tilfælde af polycystisk ovariesyndrom (PCOS), for tidlig ov…

Materials

General
Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml	Thermo Fisher	15240062	2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2)
DMEM/F12 (500ml)	Sigma-Aldrich	D8062	Handling and Maturation Medium
DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml	Thermo Fisher	14190144
FCS (100 ml)	Thermo Fisher	16140063	10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.)
PBS (1x, pH 7.4) 500ml	Thermo Fisher	10010023
TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml	Cayman Chemicals	600232	1x final concentration. Other brand can be use
Maturation Medium
hCG (1 VIAL of 10 000 U)	Sigma-Aldrich	CG10
PMSG	BioVendor	RP1782721000
Fibrin-alginate beads
Alginate Lyase	Sigma-Aldrich	A1603	(Step 2.11.1)
Thrombin	Sigma-Aldrich	T9326-150UN	(Step 2.1)
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C5670	(Step 2.1)
Fibrinogen (250mg)	Sigma-Aldrich	F3879	(Step 2.2)
Sodium Alginate	Sigma-Aldrich	W201502	(Step 2.3) use for alginate solution
Liquid Marble
FEP	Dyneon GmbH 3M AdMD	A-66670
Morphological examination
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells	Thermo Fisher	L3224	(Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm – EthD-1
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	mounting medium
Ultrastructure examination
Glutaraldehyde solution	Sigma-Aldrich	G5882	2.5% final concentraion (Step 4.2.1.)
LR White resin	Sigma-Aldrich	L9774	(Step 4.2.4.)
Methylene blue	Sigma-Aldrich	M9140	(Step 4.2.5.)
Osmium Tetroxide	Sigma-Aldrich	O5500	(Step 4.2.3.)
Sodium cacodylate trihydrate	Sigma-Aldrich	C0250	Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2)
Uranyl Acetate	POCH	868540111	(Step 4.2.4.)
Specific instruments, tools
30 mm Pteri dish	TPP	93040
60 mm IVF Petri dish	Falcon	353653
Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor	RI Life Sciences	8-72-288
Ez-Tip	RI Life Sciences	8-72-4155/20
Heating Table	SEMIC		Other brands can be used
Incubator	Panasonic	MCO-170AIC-PE	Other brands can be used
Sterile petri dish (10 cm)	NEST Biotechnology	704002
Sterile syringe filters with 0.2 µm	GOOGLAB SCIENTIFIC	GB-30-022PES
Thermos	Quechua	5602589	Other brands can be used