Caratterizzazione delle proprietà di trasporto intra-cartilagine dei portatori di peptidi cationici

Sommario

Questo protocollo determina l'assorbimento dell'equilibrio, la profondità di penetrazione e il tasso di diffusione non di equilibrio per i portatori di peptidi cationici nella cartilagine. La caratterizzazione delle proprietà di trasporto è fondamentale per garantire una risposta biologica efficace. Questi metodi possono essere applicati per la progettazione di un vettore di droga carica in modo ottimale per indirizzare i tessuti caricati negativamente.

Abstract

Diversi tessuti caricati negativamente nel corpo, come la cartilagine, presentano una barriera alla consegna mirata del farmaco a causa della loro alta densità di aggrecans caricati negativamente e, quindi, richiedono metodi di targeting migliorati per aumentare la loro risposta terapeutica. Poiché la cartilagine ha un'alta densità di carica fissa negativa, i farmaci possono essere modificati con vettori di farmaci caricati positivamente per sfruttare le interazioni elettrostatiche, consentendo un migliore trasporto di farmaci intra-cartilagine. Studiare il trasporto dei portatori di farmaci è quindi fondamentale per prevedere l'efficacia dei farmaci nell'indurre una risposta biologica. Mostriamo la progettazione di tre esperimenti che possono quantificare l'assorbimento dell'equilibrio, la profondità di penetrazione e il tasso di diffusione non di equilibrio dei portatori di peptidi cationici negli espianti della cartilagine. Gli esperimenti di assorbimento dell'equilibrio forniscono una misura della concentrazione soluta all'interno della cartilagine rispetto al bagno circostante, che è utile per prevedere il potenziale di un vettore di farmaci nell'migliorare la concentrazione terapeutica di farmaci nella cartilagine. La profondità degli studi di penetrazione mediante microscopia confocale consente la rappresentazione visiva della diffusione del soluto 1D dalla zona superficiale a quella profonda della cartilagine, che è importante per valutare se i soluti raggiungono la loro matrice e i siti di destinazione cellulare. Gli studi sul tasso di diffusione non-equilibrio utilizzando una camera di trasporto progettata su misura consentono di misurazione della forza delle interazioni leganti con la matrice tissunte caratterizzando i tassi di diffusione dei soluti fluoreescenti etichettati attraverso il tessuto; questo è utile per la progettazione di vettori di forza di legame ottimale con cartilagine. Insieme, i risultati ottenuti dai tre esperimenti di trasporto forniscono una linea guida per la progettazione di vettori di farmaci a pagamento in modo ottimale che sfruttano interazioni di carica deboli e reversibili per le applicazioni di consegna di farmaci. Questi metodi sperimentali possono anche essere applicati per valutare il trasporto di farmaci e coniugati porta-droga. Inoltre, questi metodi possono essere adattati per l'uso nel targeting di altri tessuti caricati negativamente come menisco, cornea e l'umorismo vitreo.

Introduzione

La consegna di farmaci a tessuti caricati negativamente nel corpo rimane una sfida a causa dell'incapacità dei farmaci di penetrare in profondità nel tessuto per raggiungere i siti di destinazione delle cellule e delle^{matrici 1}. Molti di questi tessuti comprendono aggrecans densamente imballati e caricati negativamente che creano un'alta densità di carica fissa negativa (FCD)^{2 all'interno} del tessuto e fungono da barriera per la consegna della maggior parte delle macromolecole^3,4. Tuttavia, con l'assistenza di portatori di farmaci caricati positivamente, questa b....

Protocollo

Sono state ottenute approvazioni universitarie per condurre gli esperimenti con tessuti morti. Le articolazioni bovine sono state ottenute commercialmente da un macello.

1. Estrazione espianto della cartilagine

1. Utilizzando un bisturi (lama #10), tagliare e rimuovere grasso, muscoli, legamenti, tendini e tutto il tessuto connettivo per esporre la cartilagine dalla scanalatura femoropatellare delle articolazioni del ginocchio bovino.
2. Utilizzando punzoni dermici da 3 mm e 6 mm, effettuare punzoni perpendicolari nella cartilagine per estrarre le spine cilindriche. Posizionare immediatamente i tappi in singoli pozzetti di una....

Risultati

Dopo l'assorbimento dell'equilibrio dei CPC per cartilagine, la fluorescenza del bagno diminuisce quando il soluto è stato risvegliato dal tessuto. Tuttavia, se il valore di fluorescenza del bagno finale rimane simile all'iniziale, indica che non vi è alcun/minimo soluto. Un'altra conferma dell'assorbimento soluto è se il tessuto ha visibilmente cambiato colore al colore del colorante fluorescente. L'assorbimento quantitativo dei soluti nella cartilagine è stato determinato utilizzando il rapporto di assorbimento (R_.......

Discussione

I metodi e i protocolli qui descritti sono significativi per il campo della consegna mirata di farmaci ai tessuti caricati negativamente. A causa dell'alta densità di aggrecans caricati negativamente presenti in questi tessuti, viene creata una barriera, impedendo così ai farmaci di raggiungere i loro siti di destinazione cellulari che si trovano in profondità all'interno della matrice. Per affrontare questa sfida in sospeso, i farmaci possono essere modificati per incorporare vettori di droga caricati positivamente che .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Rondella SAE in acciaio inossidabile 316	McMaster-Carr	91950A044	Per vite numero 5, 0,14" ID, 0,312"
OD Piastra in polistirene a 96 pozzetti	Fisherbrand	12566620
Foglio di spessore acrilico	Polimero Reynolds	N/A	Per diffusione in non equilibrio e camera di trasporto di diffusione 1D
Gibco		15240062	100x
Ricerca sulla cartilagine bovina	87	N/A	2-3 settimane, solco femoro-rotuleo
Siero bovino Albumina	Fisher BioReagents	BP671-1
CPC+14	LifeTein	LT1524	Peptide progettato su misura
CPC+20	LifeTein	LT1525	Peptide progettato su misura
CPC+8	LifeTein	LT1523	Custom peptide progettato
Tergicristalli per compiti delicati	Kimberly-Clark Professional	34155
Punzone dermico	MedBlades	MB5-1	3, 4 e 6 mm
Fisherbrand		12550A3
Piastre per colture cellulari a fondo piatto	Corning Costar	3595	Pellicola di avvolgimento flessibile trasparente a 96 pozzetti
	Bemis Parafilm M Laboratorio	1337412
Coperchio con guarnizione in oro	Microscopia elettronica	Scienze 6378701	# 1.5, 18x18 mm
Perforatore a percussione	McMaster-Carr	3427A15	1/2" di diametro
	McMaster-Carr	3427A19	/4" di diametro
Laser	Chroma Technology	AT480/30m	Spettrofotometro Laser
Dado esagonale in acciaio leggero a bassa resistenza	McMaster-Carr	90480A007	6-32 Dimensione filettatura
LSM 700 Microscopio confocale	Zeiss	LSM 700
Micro Barre di agitazione magnetiche	Bel-Art Spinbar	F37119-0007	7x2 mm
Foglio di gomma neoprene multiuso	McMaster-Carr	1370N12	1/32" Spessore
Latte bovino secco scremato	Sigma Aldrich	M7409
Piastra di Petri Vetro	chimico per le scienze della vita	CGN1802145	150 mm di diametro
salina tamponata con fosfato	Corning	21-040-CMR	1x
Agitatore per piastre	VWR	89032-088
Inibitori della proteasi	Thermo Scientific	A32953
Lamette da barba	Fisherbrand	12640
Foglio di spessore sottile acrilico R-Cast	Polimero Reynolds	N/A	Inserti per camera di trasporto nero
RTV	Silicone Loctite	234323	epossidico, non corrosivo, trasparente
Bisturi	TedPella	549-3	#10, #11 lame
Ricevitore di segnale Tecnologia	Chroma Tecnologia Chroma	ET515lp	Ricevitore di segnale laser
Microcentrifuga con tappo a scatto Provette	Eppendorf	22363204	1,5 mL
Spatola	TedPella	13508
Synergy H1 Lettore di micropiastre	Biotek	H1M
Vite a brugola in acciaio legato zincato	McMaster-Carr	90128A153	6-32 Filettatura, 1" di lunghezza

nero Vetrini per microscopio in vetro semplice economico da in vetro Perforatore a martello da 3 Soluzione Spettrofotometro