ग्लूटाथिएक एस-ट्रांसफरेस (जीटीएस) कई कीमोथेर्यूटिक दवाओं के मेटाबोलिज्म में शामिल विषहरण एंजाइम हैं। जीटीएस का अतिव्यवसंबंध कैंसर कीमोथेरेपी प्रतिरोध से सहसंबद्ध है। इस फेनोटाइप का मुकाबला करने का एक तरीका अवरोधकों का उपयोग करना है। यह प्रोटोकॉल संभावित जीएसटी अवरोधकों के लिए स्क्रीन करने के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक परख का उपयोग करके एक विधि का वर्णन करता है।
ग्लूटाथिएक एस-ट्रांसफरेस (जीटीएस) मेटाबोलिक एंजाइम हैं जो ग्लूटाथिएक (जीएसएच) कंजूगेशन द्वारा अंतर्जात या बहिर्जात इलेक्ट्रोफिलिक यौगिकों के उन्मूलन के लिए जिम्मेदार हैं। इसके अलावा, जीटीएस माइटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनासेस (एमएपीके) के नियामक हैं जो एपोटोटिक रास्तों में शामिल हैं। जीटीएस का अतिव्यवसंगत विद्युत एल्किलाटिंग एजेंटों के साथ कीमोथेरेपी से गुजरने वाले रोगियों के बीच कम चिकित्सीय प्रभावकारिता से सहसंबद्ध है। जीएसटी अवरोधकों का उपयोग करना इस प्रवृत्ति को पलटने और उपचार शक्ति को बढ़ाने के लिए एक संभावित समाधान हो सकता है। इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए एक सटीक, त्वरित और आसान एंजाइम परख के साथ ऐसे यौगिकों की खोज की आवश्यकता होती है। 1-क्लोरो-2,4-डिनिट्रोबेनजेन (सीडीएनबी) का उपयोग करके एक स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक प्रोटोकॉल साहित्य में सबसे अधिक नियोजित विधि है। हालांकि, पहले से ही वर्णित जीएसटी निषेध प्रयोग एक इष्टतम निषेध परख के प्रत्येक चरण का ब्यौरा प्रोटोकॉल प्रदान नहीं करते हैं, जैसे सीडीएनबी के लिए माइकलिस-मेंटेन स्थिर (KM)का माप या नियोजित एंजाइम एकाग्रता का संकेत, एक परीक्षण यौगिक की निषेध शक्ति का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण पैरामीटर। इसलिए, इस प्रोटोकॉल के साथ, हम संभावित अवरोधकों के पुस्तकालयों को स्क्रीन करने के लिए एक अनुकूलित स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक जीएसटी एंजाइम परख के प्रत्येक चरण का वर्णन करते हैं। हम आधा अधिकतम अवरोधक एकाग्रता (IC50) और अवरोध के निरंतर (K i) की गणना की व्याख्याकरते हैं-एंजाइम अवरोधक की शक्ति को मापने के लिए उपयोग की जाने वाली दो विशेषताएं। वर्णित विधि को कोशिकाओं या शुद्ध पुनर्संयोजन मानव जीटीएस से निकाले गए जीटीएस के पूल का उपयोग करके लागू किया जा सकता है, नामत जीएसटी अल्फा 1 (जीएसटीए1), जीएसटी म्यू 1 (जीएसटीएम1) या जीएसटी पीआई 1 (जीएसटीपी1)। हालांकि, इस प्रोटोकॉल को जीएसटी थीटा 1 (जीएसटीटी1) पर लागू नहीं किया जा सकता है, क्योंकि सीडीएनबी इस आइसोफॉर्म के लिए सब्सट्रेट नहीं है। इस विधि का उपयोग घोड़े के जिगर से जीटीएस का उपयोग करके करक्यूमिन की निषेध शक्ति का परीक्षण करने के लिए किया गया था। करक्यूमिन कैंसर विरोधी गुणों का प्रदर्शन करने वाला एक अणु है और सिलिको डॉकिंग भविष्यवाणियों के बाद जीएसटी आइसोफॉर्म के प्रति आत्मीयता दिखाई। हमने दिखा दिया कि करक्यूमिन एक शक्तिशाली प्रतिस्पर्धी जीएसटी अवरोधक है, जिसमें 31.6 ± 3.6 माइक्रोनएमका आईसी50 और 23.2 ± 3.2 माइक्रोन की एक के आई है। करक्यूमिन में अपनी प्रभावकारिता में सुधार करने के लिए इलेक्ट्रोफिलिक कीमोथेरेपी दवा के साथ संयुक्त होने की क्षमता है।
साइटोसोलिक ग्लूटाथिएक एस-ट्रांसफरेस एंजाइम (जीटीएस, ईसी 2.5.1.18) ने ग्लूटाथिएक (जीएसएच) के संयुग्मण को विभिन्न इलेक्ट्रोफिलिक यौगिकों जैसे कीमोथैरेपी एजेंटों में उत्प्रेरित किया, ताकि उन्हें शरीर से आसानी से डिटॉक्सिफाई और खत्म किया जा सके1। साइटोसोलिक जीएसटी के सात आइसोफॉर्म की पहचान अल्फा, एमयू, पीआई, सिग्मा, ओमेगा, थेटा और जीटा के रूप में की गई है। जीटीएस मुख्य रूप से यकृत, वृषण, फेफड़ों और गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट 2 में व्यक्त किएजातेहैं। जीएसटी अल्फा 1 (जीएसटीए1) आइसोफॉर्म हेपेटोसाइट्स में अत्यधिक व्यक्त किया जाता है। शरीर विषम रूप से मस्तिष्क, हृदय और फेफड़ों में जीएसटी पीआई 1 (जीएसटीपी1) और यकृत में जीएसटी म्यू 1 (जीएसटीएम1) सहित अन्य उपप्रकारों को व्यक्त करता है और3टेस्ट करता है। यद्यपि जीएसटी आइसोफॉर्म के बीच उच्च अनुक्रम होमोलॉजी है, प्रत्येक अपनी अंतर अभिव्यक्ति4, 5,के अनुसार, विशिष्टता को दर्शाता है और विभिन्न तरीकों से दवा चयापचय और कैंसर में फंसायाजाताहै।
इलेक्ट्रोफिलिक यौगिक या तो शरीर में एक्सोजेनोसी रूप से प्रवेश करते हैं या अंतर्जात रूप से उत्पादित होते हैं। कीटनाशक, प्रोस्टाग्लैंडिन, कार्सिनोजन और कीमोथैरेप्टिक दवाएं ग्लूटाथिएक कंजूगेशन प्रतिक्रियाओं6के लिए कुछ संभावित सब्सट्रेट्स हैं। उदाहरण के लिए, एक कोशिका के भीतर गठित किसी भी इलेक्ट्रॉन की कमी प्रतिक्रियाशील यौगिक एक इलेक्ट्रोफिलिक सब्सट्रेट बनने की संभावना है । क्लोरैम्बुसिल या मेलफालन जैसे एल्किलेटिंग एजेंटों को जीटीएस द्वारा उत्प्रेरित जीएसएच के संजूगेट के रूप में समाप्त कर दिया जाता है, और इन एंजाइमों के बढ़े हुए स्तर को इन यौगिकों के प्रतिरोध के साथ सहसंबद्ध किया गया है6,,7।
साइटोसोलिक जीटीएस की एक और महत्वपूर्ण भूमिका मिटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनासेस (एमएपीके) जैसे MAPK8 (जिसे सी-जून एन-टर्मिनल किनेज़, या जेएनके 1 के रूप में भी जाना जाता है) और MAP3K5 (जिसे एपोप्टोसिस सिग्नल-विनियमन किनेज 1, या ASK1 के रूप में भी जाना जाता है)8की गतिविधि को विनियमित करना है। उनके मोनोमेरिक संरचना में कुछ आइसोफॉर्म इन प्रोटीन से बांधेंगे और इस तरह फॉस्फोरिलेशन झरना को ब्लॉक कर देंगे। सामान्य परिस्थितियों में, GSTP1 आइसोफॉर्म MAPK8 (सी-जून प्रोटीन का सक्रियक) को अलग करेगा। सी-जून को सी-फोस प्रोटीन के साथ मिलाकर एक्टिवेटर प्रोटीन 1 (एपी-1) ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर बनाता है, जो प्रो-एपोटोटिक जीन को पार करने के लिए जिम्मेदार है । तनावग्रस्त कोशिकाओं में, GSTP1 और MAPK8 द्वारा गठित परिसर अलग हो जाता है, सी-जून सक्रिय होता है, और एपोप्टोसिस के लिए अग्रणी जीन9व्यक्त किए जाने लगते हैं। इसलिए इस जीएसटी आइसोफॉर्म की अधिक अभिव्यक्ति मार्ग को अवरुद्ध कर सकती है, जिससे सेल व्यवहार्यता में वृद्धि, अधिक सेलुलर प्रसार और कीमोथेरेपी के प्रति कम सेलुलर संवेदनशीलता हो सकती है। इसी तरह के परिदृश्य GSTP1 के पैरालॉग के साथ हो सकते हैं, उदाहरण के लिए, GSTM1, जो MAP3K510के साथ बातचीत करता है।
जीटीएस द्वारा नशीली दवाओं के चयापचय और एमएपीके के ज़ब्ती में निभाई गई भूमिकाओं से यह परिकल्पना हुई कि जीटीएस की अधिक अभिव्यक्ति कीमोथैरेपी उपचार6,11के लिए ट्यूमर प्रतिरोध तंत्र का संकेत हो सकती है । उदाहरण के लिए, जीएसटीपी 1 कई कैंसरों में अधिक अनुमानित है और इसकी उपस्थिति खराब पूर्वानुमान और पतन8की बढ़ी हुई घटनाओं से सहसंबद्ध है। इन जीनों में बहुरूपता ने विभिन्न रोगों को पेश करने वाले रोगियों के लिए अंतर दवा जोखिम और जीवित रहने की दर भी दिखाई है, इस विचार को मजबूत किया है कि ये एंजाइम दवा प्रतिरोध के तंत्र के लिए महत्वपूर्ण हैं । उदाहरण के लिए, जीएसटीएम1 नल जीनोटाइप वाले व्यक्ति कम दवा निकासी और बेहतर अस्तित्व12, 13,से जुड़ेहुएहैं। इस अतिव्यक्तता का मुकाबला करने के कई संभावित साधन हैं, जैसे जीएसएच एनालॉग का उपयोग, प्रोड्रग जो जीटीएस के साथ संयुग्मण द्वारा सक्रिय होते हैं, या प्रत्यक्ष जीएसटी अवरोधक14,,15।
इन सभी तरीकों की जांच की जा रही है, और कुछ यौगिकों रोगियों के बीच अपने संभावित उपयोग के लिए नैदानिक परीक्षण शुरू कर दिया है । हालांकि, हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, नैदानिक सेटिंग्स15में जीएसटी अवरोधक के रूप में उपयोग में कोई यौगिक नहीं हैं। दरअसल, कुछ आइसोफॉर्म के लिए विशिष्टता की कमी या सामान्य कोशिकाओं में जीएसएच की कमी, जो अंग प्रणालियों में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के संचय के कारण विषाक्तता का कारण बन सकती है, कुछ कमियां हैं जो जीएसटी अवरोधकों की क्षमता को कम करती हैं14,,15। जोखिम है कि इन यौगिकों शरीर पर अन्य फार्माकोडायनामिक प्रभाव डालती हो सकता है भी उनके उपयोग को सीमित कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, एथाक्र्रिनिक एसिड प्रयोगशाला वातावरण में सबसे व्यापक रूप से अध्ययन किया गया जीएसटी अवरोधक है, लेकिन क्योंकि यह मुख्य रूप से एक मजबूत मूत्रवर्धक के रूप में उपयोग किया जाता है, यह संपत्ति नैदानिक सेटिंग्स में अन्य दवाओं के संयोजन में इसके उपयोग को सीमित करती है। करक्यूमिन एक और प्राकृतिक यौगिक है जो सफलतापूर्वक जीएसटी अवरोधक के रूप में दिखाई जाती है। यह अणु हल्दी की करक्यूमा लोंगा प्रजाति से निकाला गया पॉलीफेनॉल ईथर है। इसने विभिन्न प्रकार के ट्यूमर सेल लाइनों16,17के एपोप्टोसिस को प्रेरित करके कैंसर के खिलाफ संभावित उपचार विकल्प के रूप में आशाजनक परिणाम दिखाए हैं । यह यौगिक विभिन्न सेलुलर रास्तों को विनियमित कर सकता है, जैसे टायरोसिन किनेज18 या जीएसटी मार्ग। शुद्ध प्रोटीन वाले अध्ययनों ने जीएसटीए1, जीएसटीएम1 और जीएसटीपी19,,20पर अपनी अवरोध शक्ति को दर्शाया है। हालांकि, कैंसर कोशिकाओं में परस्पर विरोधी परिणाम देखे गए, जहां कोशिकाओं को करक्यूमिन21के साथ इलाज किए जाने पर अधिक अंतरकोशिकीय जीएसटी गतिविधि को मापा गया था। इस प्रकार, किसी भी आगे सेलुलर प्रयोगों की योजना बनाने से पहले उचित नियंत्रण के साथ स्पष्ट रूप से वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके किसी भी ख्यात जीएसटी अवरोधक के आधे अधिकतम अवरोधक एकाग्रता (IC50) और किसी भी ख्यात जीएसटी अवरोधक के निरंतर अवरोध (केआई)की जांच करना महत्वपूर्ण है।
स्क्रीनिंग और परीक्षण संभावित नए जीएसटी अवरोधकों इसलिए महत्वपूर्ण नैदानिक हित के हैं, और किसी भी नए यौगिक पाया विद्युत दवाओं के साथ संयोजन में उपयोग के लिए सुरक्षित और कुशल होना चाहिए । आइसोफॉर्म-विशिष्ट अवरोधकों पर शोध केंद्रित करने से जीएसटी अभिव्यक्ति के विशिष्ट पैटर्न का प्रदर्शन करने वाले ट्यूमर ऊतकों में जीएसटी अवरोध सक्षम हो सकता है, इस प्रकार एक प्रभावी संयोजन चिकित्सा के विकास की अनुमति मिल सकती है। अवरोध के अंतर मोड के साथ अवरोधकों को ढूंढना भी रुचि का हो सकता है। उदाहरण के लिए, एक प्रतिस्पर्धी अवरोधक जो जीएसएच को सब्सट्रेट के रूप में उपयोग करता है, इसकी कमी को प्रेरित कर सकता है। कोशिकाओं में जीएसएच एकाग्रता की यह कमी न्यूरॉन्स में ऑक्सीडेटिव तनाव को प्रेरित करने के लिए दिखाई गई थी, जिससे एपोप्टोसिस होता है। अवरोध का एक और सामान्य तरीका- अप्रतिस्पर्धी अवरोध- भले ही सब्सट्रेट उच्च सांद्रता में मौजूद हो।
एंजाइमेटिक गतिविधि की दर का प्रतिनिधित्व माइकलिस-मेंटेन स्थिर (केएम)और अधिकतम वेग (वीमैक्स)द्वारा किया जाता है, जिसे माइकलिस-मेंटेन ग्राफ की साजिश रचने से निर्धारित किया जा सकता है, प्रतिक्रिया23के वेग के खिलाफ सब्सट्रेट एकाग्रता के साथ। कश्मीरएम आधे एंजाइमैटिक सक्रिय साइटों पर कब्जा करने के लिए आवश्यक सब्सट्रेट की एकाग्रता है, जिसका अर्थ है कि एक उच्च कश्मीरएम कम आत्मीयता का प्रतिनिधित्व करता है। वीमैक्स प्रतिक्रिया के अधिकतम वेग का प्रतिनिधित्व करता है, जब सभी सक्रिय साइटों पर सब्सट्रेट द्वारा कब्जा कर लिया जाता है। कश्मीरएम आधा वीअधिकतमके बराबर है । अवरोध के तीन सबसे आम तरीके हैं: प्रतिस्पर्धी, अप्रतिस्पर्धी, और गैर प्रतिस्पर्धी। प्रतिस्पर्धी अवरोध के मामले में, अवरोधक एंजाइम की सक्रिय साइट से बांधता है और सब्सट्रेट के साथ प्रतिस्पर्धा करता है। इसलिए, वीमैक्स अवरोधक के अलावा के बाद नहीं बदलता है, लेकिन कश्मीरएम बढ़ जाता है, क्योंकि अवरोध का मुकाबला करने के लिए अधिक सब्सट्रेट की आवश्यकता होती है। अप्रतिस्पर्धी अवरोध तभी होता है जब सब्सट्रेट एंजाइम के साथ एक जटिल बनाता है। इस मामले में, अवरोध का स्तर सब्सट्रेट और एंजाइम एकाग्रता पर निर्भर करता है, जब अवरोधक प्रतिक्रिया में जोड़ा जाता है तो वीमैक्स और केएम कम हो जाते हैं। अवरोध का अंतिम तरीका गैर-प्रतिस्पर्धी है और दो अन्य अवरोध पैटर्न का मिश्रण है। अवरोधक एंजाइम की सक्रिय साइट से बांध सकता है कि एंजाइम अपने सब्सट्रेट से बंधा हुआ है या नहीं। यहां वीअधिकतम अवरोधक के अलावा के बाद कम हो जाती है, लेकिन कश्मीरएम 24नहीं बदलता है ।
जीएसटी गतिविधि को मापा जाने वाला एक स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक परख पहली बार हबिग एट अल द्वारा विकसित किया गया था। 1 9 74 में 1-क्लोरो-2,4-डिनिट्रोबेनजेन (सीडीएनबी) का उपयोग करके प्रतिक्रिया22के लिए सब्सट्रेट के रूप में। जीएसएच और सीडीएनबी के बीच संजुर्गन जीएस-डीएनबी बनाता है, जो 340 एनएम की तरंगदैर्ध्य पर अधिकतम प्रकाश अवशोषण प्रदर्शित करता है, जो स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ रिकॉर्ड किया जा सकता है। नीचे बताई गई अधिकांश तकनीक हबिग एट अल से ली गई है, जिसमें एक निरोधात्मक परख के लिए सर्वोत्तम सेटिंग्स और महत्वपूर्ण अनुकूलन बिंदुओं के बारे में जानकारी शामिल है। इस तकनीक को संभावित जीएसटी अवरोधकों की स्क्रीनिंग के लिए लागू किया जा सकता है, चाहे वह कम्प्यूटेशनल भविष्यवाणियों का उपयोग करके तर्कसंगत दवा चयन द्वारा चुना गया हो या साहित्य की समीक्षा द्वारा। प्रोटोकॉल को नए संश्लेषित जीएसटी प्रोटीन या विशिष्ट आइसोफॉर्म में कैसे ढाला जाए, इस पर भी चर्चा की जाती है। उदाहरण के लिए, रोगी-विशिष्ट जीसीटी को लक्षित करते हुए, इस प्रोटोकॉल के लिए संभावित उपयोग हो सकता है, जो चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक बहुरूपता या एकल-न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (SNPs) का प्रदर्शन करने वाले जीएसटी आइसोफॉर्म की निरोधात्मक शक्ति का परीक्षण करना संभावित उपयोग हो सकता है।
यह प्रोटोकॉल किसी भी अन्य कार्यात्मक अध्ययन से पहले विट्रो में संभावित जीएसटी अवरोधकों की स्क्रीनिंग के लिए एक त्वरित, व्यवहार्य और प्रभावी तरीका प्रदान करता है। एक एंजाइमेटिक अवरोधक की सबसे अधिक मापी गई विशेषताओं का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक कदमों का वर्णन किया गया है: निरोधात्मक एकाग्रता 50 (IC50) जो एंजाइमेटिक गतिविधि को आधे से कम करने के लिए आवश्यक अवरोधक की एकाग्रता है; और अवरोध का निरंतर (केआई)जो अवरोधक और एंजाइम के बीच विघटन के संतुलन के संतुलन का प्रतिनिधित्व करता है, इन दो अणुओं के बीच आत्मीयता की विशेषता है। इन दो मूल्यों को गैर-रैखिक प्रतिगमन द्वारा मापा जाता है और क्रमशः अवरोध के प्रत्येक मोड के लिए विशिष्ट समीकरणों का उपयोग करके। हम अवरोध के इस पैटर्न का आकलन भी प्रदर्शित करते हैं, माइकलिस-मेंटेन भूखंडों,का उपयोग करके अवरोधक23, 25,,26के अलावा वीमैक्स और केएम के परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए।26
हम एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जो स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक जीएसटी एंजाइम परख के प्रत्येक चरण का वर्णन करते हैं, ख्यात अवरोधकों(चित्र 1, तालिका 1)को स्क्रीन करने और उनकी निरोधात्मक शक्ति की मात्रा निर्धारित करने के लिए। हमने प्रजनन योग्य परिणाम प्रदान करने वाले सटीक एंजाइम परख के लिए विचार करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण मानदंडों पर भी जोर दिया। अन्य रंग-द्रव विधियों या मास स्पेक्ट्रोमेट्री पर वर्णित प्रोटोकॉल के प्रमुख फायदे यह है कि यह प्रोटोकॉल जीएसटी गतिविधि के मात्रात्मक माप के साथ-साथ जांच किए गए अणुओं की निषेध शक्ति को करने और प्रदान करने में त्वरित और आसान है।
हम एक एंजाइम अवरोधक के दो सबसे महत्वपूर्ण माइकल्स-मेंटेन मापदंडों की गणना करने का तरीका पेश करते हैं: IC50 और KI। एक शक्तिशाली अवरोधक सबसे कम संभव कश्मीरमैं और IC50 लागू करेगा, यह दर्शाता है कि अवरोधक और एंजाइम के बीच आत्मीयता उच्च30है । चूंकि IC50 एंजाइम एकाग्रता और परख की स्थितियों पर निर्भर है,इसलिए विभिन्न प्रयोगों से अवरोधकों की तुलना करने या अन्य परख शर्तों का उपयोग करके प्राप्त करने के लिए इस मूल्य का उपयोग करना कठिन हो सकता है34. अवरोध कश्मीर के निरंतर का उपयोग करनामैं संभावित यौगिकों की निरोधात्मक शक्ति का एक बेहतर संकेतक है। कश्मीरमुझे अवरोध के विभिन्न तरीकों के साथ दो अवरोधकों की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, क्योंकि यह पूरी तरह से अवरोधक और एंजाइम के बीच आत्मीयता पर निर्भर करता है। हालांकि, अवरोध की प्रकृति का एक स्पष्ट विचार है एक अवरोधक के मापदंडों के दोनों निर्धारित करना चाहिए30। हमने करक्यूमिन्स के आईसी50 और केआई को क्रमशः 31.6 ± 3.6 माइक्रोनएम और 23.2 ± 3.2 माइक्रोनएम मापा, यह दर्शाता है कि यह यौगिक एक शक्तिशाली जीएसटी अवरोधक है। इन परिणामों ने सिलिको भविष्यवाणियों में पुष्टि की, जिसने अनुमानलगाया कि विभिन्न मानव जीएसटी आइसोफॉर्म और करक्यूमिन के लिए 27.4 से 78.1 माइक्रोन के बीच के आई मूल्य हैं।
एंजाइमेटिक गतिविधि या प्रतिक्रिया की दर और एंजाइम की मात्रा
जैसा कि ऊपर कहा गया है, IC50 एंजाइम एकाग्रता पर निर्भर है, और एंजाइमेटिक गतिविधि के अज्ञात स्तर के साथ एक प्रयोग करने से झूठे निष्कर्ष33हो सकते हैं। अन्य कारकों के लिए नियंत्रित करने के लिए, जो निरोधात्मक गतिविधि को कम कर सकता है, किसी को जीएसटीएस के प्रत्येक नए बैच के लिए एंजाइमेटिक गतिविधि पर विचार करना चाहिए और मापना चाहिए। उदाहरण के लिए, एक एंजाइमेटिक बैच का क्षरण, बहुत अधिक फ्रीज/गल चक्र के कारण, गतिविधि में कमी आ सकती है और इस प्रकार एक कम IC50 के लिए नेतृत्व भले ही प्रयोग एक ही शर्तों के तहत चलाया गया था । दूसरे शब्दों में, एंजाइम की 0.01 इकाइयों का उपयोग करके 1 इकाई का उपयोग करने के समान परिणाम नहीं देंगे। बहुत सारे एंजाइमों का उपयोग करने से सब्सट्रेट की तेजी से कमी हो सकती है और प्रतिक्रिया में रैखिक आकार नहीं होगा। इस प्रकार यह पैरामीटर सटीक परिणाम का कारण बन सकता है, क्योंकि लंबे इनक्यूबेशन समय के बाद अवशोषण में कोई परिवर्तन नहीं देखा जाएगा।
कश्मीरएम वैल्यू
एक अवरोधक द्वारा प्रदर्शित अवरोध के प्रकार का आकलन करने के लिए सबसे अच्छी स्थिति सुनिश्चित करने के लिए, सब्सट्रेट एकाग्रता माइकलिस-मेंटेन स्थिर (KM)के बराबर या नीचे होनी चाहिए। केएम का प्रतिनिधित्व एंजाइम28पर आधी सक्रिय साइटों पर कब्जा करने के लिए आवश्यक सब्सट्रेट की एकाग्रता द्वारा किया जाता है । उदाहरण के लिए, उच्च सब्सट्रेट एकाग्रता एक प्रतिस्पर्धी अवरोधक का प्रतिकार कर सकती है और इस प्रकार के अवरोध का आकलन करना ऐसी सेटिंग में मुश्किल होगा। इस प्रकार, इस पद्धति में महत्वपूर्ण चरणों में से एक चयनित सब्सट्रेट (यहां सीडीएनबी) के लिए एंजाइम के केएम का निर्धारण है। कुछ अध्ययनों में, यह मूल्य निर्धारित नहीं किया गया था और इससे अवरोधक के कारण अवरोध के पैटर्न के बारे में झूठे निष्कर्ष निकल सकते हैं, और, यदि अवरोध का तरीका गलत है, तो कश्मीर की गणना गलततरीके से की जाएगी क्योंकि समीकरण अवरोध26,,28की तर्ज पर निर्भर करता है। यदि एक अलग जीएसटी आइसोफॉर्म का परीक्षण किया जाता है, तोकेएम मूल्य का एक नया आकलन अनिवार्य है, क्योंकि यह मूल्य एंजाइम और लिगामेंट की एक जोड़ी के लिए अद्वितीय है। जैसा कि हमनेकेएम (0.2 m M) की तुलना में सीडीएनबी की एकाग्रता का उपयोग किया, जिसे हमने 0.26 ± 0.08 m M M के रूप में परिभाषित किया, जीएसटी पर करक्यूमिन के अवरोध की भविष्यवाणी की गई प्रतिस्पर्धी मोड सटीक रूप से निर्धारित की गई थी।
आईसी50
एक अच्छा सिग्मोइडल वक्र प्राप्त करना जिसके साथ IC50 का अनुमान लगाने के लिए नीचे और शीर्ष दोनों पठारों को खोजने की आवश्यकता होती है। नीचे का पठार एक अवरोधक की सांद्रता का प्रतिनिधित्व करता है जो अधिकतम निरोधात्मक गतिविधि प्रदान करता है। कुछ मामलों में, एक यौगिक एंजाइम को पूरी तरह से बाधित नहीं कर सकता है, यहां तक कि उच्च सांद्रता पर, क्योंकि घुलनशीलता जैसे तकनीकी मुद्दों के कारण। हालांकि, ग्राफपैड चश्मे जैसे उपकरण नीचे के पठार को काफी सटीक रूप से फिट कर सकते हैं। शीर्ष पठार अवरोधक की सांद्रता से बना है, जो एंजाइम को बाधित करने के लिए अपर्याप्त हैं, और इसलिए गतिविधि अधिकतम है। ये दोनों पठार आईसी50 के साथ-साथ बीच में सांद्रता का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, ताकि वक्र की ढलान को खोजने के लिए-फिर IC50 को सिग्मॉयड वक्र35के आकार से प्राप्त किया जा सकता है। करक्यूमिन पानी में खराब घुलनशील है, इस प्रकार इस परख में उपयोग की जाने वाली अधिकतम एकाग्रता सीमित है, परख समाधान में वर्षा से बचने के लिए। इस प्रकार, कम केंद्रित समाधान, जो पूरी तरह से जीएसटी गतिविधि को बाधित नहीं करते हैं, का उपयोग किया गया था। यह नीचे पठार के निर्धारण के लिए मुद्दे उठाए । इस समस्या का मुकाबला करने के लिए, हमने गैर-रैखिक प्रतिगमन ग्राफ के आधार पर नीचे मूल्यों की भविष्यवाणी की, जिसने करक्यूमिन(चित्रा3 ए) के लिए 31.6 ± 3.6 माइक्रोन का IC50 प्रदान किया। एथ्रिनिक एसिड के लिए, नीचे के पठार के लिए मूल्यों की भविष्यवाणी करने की कोई आवश्यकता नहीं थी क्योंकि यह यौगिक परख समाधान में घुलनशील है और IC50 को 6.6 ± 1.1 माइक्रोनएम मापा गया था।
इस विधि को मानव में सबसे अधिक व्यक्त किए गए जीएसटी आइसोफॉर्म, अर्थात् जीएसटी1, जीएसटीएम1 या जीएसटीपी1 पर लागू किया जा सकता है। हालांकि, यह प्रोटोकॉल जीएसटीटी1 आइसोफॉर्म की गतिविधि की मात्रा निर्धारित करने के लिए अनुकूल नहीं है, क्योंकि सीडीएनबी इस उपप्रकार के लिए सब्सट्रेट नहीं है। 36, 37 इस बीच, प्रोटोकॉल थोड़ा इस मुद्दे का मुकाबला करने के लिए संशोधित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, जीएसटीटी1 के लिए सब्सट्रेट के रूप में 1,2-एपॉक्सी-3-(4′-नाइट्रोफेनॉक्सी) प्रोपेन (एनपीपी) का उपयोग करना और 340एनएम के बजाय 360 एनएम पर संजूगेट की मात्रा को मापना। 37
सेल संस्कृति प्रयोगों में जीएसटी गतिविधि और अवरोधक परीक्षण का परीक्षण करने के लिए प्रोटोकॉल के कदम अनुकूलित और लागू किए जा सकते हैं। जीएसटी अवरोधक के साथ और बिना इलाज की जाने वाली कोशिकाओं पर जीएसटी गतिविधि का मापन यह इंगित करेगा कि इस यौगिक का उपयोग ऐसी प्रायोगिक सेटिंग में किया जा सकता है या नहीं। यह विशेष रूप से दिलचस्प है जब अवरोधक लिपोफिलिक है। उदाहरण के लिए, हमने प्रस्तुत किया कि करक्यूमिन इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके एक शक्तिशाली जीएसटी अवरोधक है। फिर भी, सेलुलर अध्ययनों के लिए इसका आवेदन सीमित हो सकता है, क्योंकि अणु पानी में खराब घुलनशील होता है और मध्यम में जल्दी से कम हो जाता है। 31 सब्सट्रेट सीडीएनबी की गैर-आइसोफॉर्म विशिष्टता के संबंध में इस प्रोटोकॉल का एक और सुधार संभव है। सेल स्टडीज में इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल करने से सिर्फ ओवरऑल जीएसटी एक्टिविटी के बारे में जानकारी मिलेगी, लेकिन सटीक जीएसटी सबटाइप की एक्टिविटी पर नहीं। आइसोफॉर्म-स्पेसिफिक सब्सट्रेट और/या विशिष्ट रिकॉम्बिनेंट जीएसटी आइसोफॉर्म का उपयोग करना आइसोफॉर्म विशिष्ट जीएसटी अवरोधकों का परीक्षण करने की अनुमति देगा।
अपनी बात समाप्त करने के लिए, हम जीएसटी अवरोधकों का परीक्षण करने के लिए एक पूरी प्रक्रिया का वर्णन करते हैं जिनका उपयोग इलेक्ट्रोफिलिक कीमोथेरेपी के संयोजन में करने की क्षमता है। हमने संभावित दिलचस्प अणु का परीक्षण करने और मात्रात्मक मूल्यों, IC50 और KIके साथ अवरोधक के रूप में उनकी दक्षता निर्धारित करने के लिए जीएसटी एंजाइम और अवरोध परख के महत्वपूर्ण कदमों पर जोर दिया। इस विधि को किसी भी ख्यात यौगिक पर लागू किया जा सकता है और सबसे अधिक व्यक्त मानव जीएसटी आइसोफॉर्म (जीएसटीए 1, जीएसटीएम 1 और जीएसटीपी 1) पर किया जा सकता है, या जीएसटी अवरोधकों के साथ सेल संस्कृति अध्ययन करने या पसंद के अन्य दिलचस्प जीएसटी आइसोफॉर्म की गतिविधि को मापने के लिए थोड़ा अनुकूलित किया जा सकता है।
अभिकर्मकों | नाम | परख समाधान में एकाग्रता | अन्य |
सब्सट्रेट | सीडीएनबी | मापा कश्मीरएम (mM) | 95% इथेनॉल में पतला। अंतिम इथेनॉल एकाग्रता 5% ≤ होनी चाहिए (v/v) |
कंजूगेटिंग सब्सट्रेट | जीएसएच | 2.5 mM | पानी में पतला। |
एकाग्रता को समाधान को तर करना चाहिए। | |||
बफ़र | पीबीएस | – | पीएच = 7.1 |
एंजाइम | जीएसटी आइसोफॉर्म या प्योर आइसोफॉर्म का पूल | 0.01 इकाई/एमएल, प्रायोगिक रूप से निर्धारित। | पानी में पतला। |
जीएसटी अवरोधक | पसंद का संभावित यौगिक | IC50: 3 सांद्रता जो अधिकतम रूप से रोकती है, 3 जो न्यूनतम रूप से रोकती है, और 3 बीच में। | DMSO में पतला और फिर पानी में, DMSO की एक अंतिम एकाग्रता ≤ 1% (v/v) |
कश्मीरमैं:IC50 के आसपास 3 सांद्रता । | |||
पैरामीटर | |||
कमरे का तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) | |||
पीएच = 7.1 | |||
DMSO ≤ 1% (v/v) | |||
इथेनॉल ≤ 5% (v/v) |
तालिका 1: जीएसटी अवरोध परख के दौरान विचार करने के लिए अभिकर् ती और मापदंडों का सारांश।
The authors have nothing to disclose.
इस शोध कार्य को कैनसर्च फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक तकनीकी सहायता के लिए सुश्री लारेंस लेस्ने और श्री योएन सरमिएंटो को स्वीकार करना चाहते हैं, विशेष रूप से नकल प्रयोगों के संचालन में, जबकि अवरोधकों के साथ परख का मानकीकरण करते हैं। श्री डेनिस मैरिनो, डॉ सिमोना म्लाकर और डॉ वड म्लाकर द्वारा सार्थक चर्चाओं और जानकारियों को बहुत स्वीकार किया जाता है । हम वीडियो के कथन के साथ उसकी मदद के लिए डॉ पेट्रीसिया Huezo-Diaz कर्टिस का शुक्रिया अदा करते हैं । हम डॉ मुथुकुमार को सिलिको भविष्यवाणियों में उनके इनपुट के लिए धन्यवाद देते हैं । हम इस पांडुलिपि के अंग्रेजी भाषा प्रूफ रीडिंग में उनकी मदद के लिए श्री डैरेन हार्ट को भी धन्यवाद देते हैं ।
1-Chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) | Sigma-Aldrich | 237329 | Substrate used for the GST enzymatic assay |
Corning UV-Transparent Microplates | Sigma-Aldrich | CLS3635 | Transparent plate to perform the enzymatic assay. When using 200 ul, the pathlength is 0.552 cm for this plate. |
Curcumin | Sigma-Aldrich | 8511 | Used for the results section, to test the inhibition potency of curcumin |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | To prepare the stock of the putative inhibitor |
DPBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Buffer for the enzymatic reaction |
Ethanol 95% | Fisher scientific | 10542382 | To dilute the CDNB |
Glutathione S-Transferase from equine liver | Sigma-Aldrich | G6511 | Used for the results section, to test the inhibition potency of curcumin |
L-glutathione reduced (GSH) | Sigma-Aldrich | G4251 | Co-substrate for the GST enzymatic assay |
Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23225 | To quantify the amount of protein present in the enzymatic solution |
Spectramax iD3 | Molecular devices | To do spectrophotometric measurments |