このプロトコルは、集束超音波血液脳関門(BBB)の開口部、結果として生じる遺伝子発現の評価、および組織学的検査による化学遺伝学的受容体の神経調節活性の測定による遺伝子送達に必要なステップを描写します。
音響標的化学遺伝学(ATAC)は、特定の神経回路の非侵襲的制御を可能にします。ATACは、集束超音波(FUS)誘導血液脳関門開口(FUS-BBBO)、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターによる遺伝子送達、および操作された化学遺伝学的タンパク質受容体およびそれらの同族リガンドによる細胞シグナル伝達の活性化の組み合わせによって、このような制御を実現します。ATACでは、単一の非侵襲的超音波アプリケーションを使用して、大脳領域と小脳領域の両方をミリメートルの精度でトランスデューシングすることが可能です。この形質導入は、後に、薬物を用いて自由に動く動物において、長期の、非侵襲的な、装置なしの神経調節を可能にすることができる。FUS-BBBO、AAV、および化学遺伝学は複数の動物で使用されてきたため、ATACは他の動物種での使用にもスケーラブルである必要があります。この論文では、以前に公開されたプロトコルを拡張し、複雑なMRI互換のFUSデバイスを必要とせずに、MRIガイダンスを使用してFUS-BBBOを使用して小さな脳領域への遺伝子送達を最適化する方法を概説します。このプロトコルでは、任意のラボで3Dプリントでき、さまざまな種やカスタム機器に合わせて簡単に変更できるマウスターゲティングおよび拘束コンポーネントの設計についても説明しています。再現性を高めるために、プロトコルでは、マイクロバブル、AAV、および静脈穿刺がATAC開発でどのように使用されたかを詳細に説明しています。最後に、ATACを利用した研究の予備調査を導くために、データの例が示されています。
光遺伝学1,2や化学遺伝学3,4,5などの回路特異的な神経調節技術の使用は、神経回路障害としての精神状態についての理解を深めました。神経回路は、通常、特定の細胞型、脳領域、分子シグナル伝達経路、および活性化のタイミングによって定義されるため、研究が難しく、脳障害の治療において制御がさらに困難です。理想的には、研究と臨床アプリケーションの両方にとって、そのような制御は非侵襲的に発揮されますが、正確で非侵襲的な神経調節の両方を達成することは困難です。例えば、神経活性薬は非侵襲的に脳に到達することができますが、脳全体に作用することによって空間特異性を欠いています。一方、脳深部電気刺激療法は、特定の脳領域を制御することはできますが、特定の細胞型を制御することが難しく、手術とデバイスの配置が必要です6。
音響標的化学遺伝学7(ATAC)は、空間的、細胞型的、および時間的特異性を備えた神経調節を提供します。これは、空間ターゲティングのための集束超音波誘発血液脳関門開口(FUS-BBBO)、細胞型特異的プロモーターの制御下で遺伝子を非侵襲的に送達するためのアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)の使用、および薬物投与を介してトランスフェクトされた神経回路を選択的に調節するための操作された化学遺伝学的受容体の3つの技術を組み合わせたものです。FUSはFDA承認の技術であり、人間の脳を含む組織の深部にミリメートルの空間精度で焦点を合わせる超音波の能力を利用しています。高出力では、FUSは本態性振戦8に対するFDA承認の治療を含む非侵襲的標的アブレーションに使用されます。FUS-BBBOは、低強度超音波と全身投与されたマイクロバブルを組み合わせて、超音波焦点で血管内で振動し、BBB9の局所的で一時的な(6-24時間)および可逆的な開口部をもたらします。この開口部は、げっ歯類10および非ヒト霊長類15において著しい組織損傷なしに、タンパク質9、10、小分子11、およびウイルスベクター7、12、13、14の脳への送達を可能にする。FUS-BBBO16,17の臨床試験が進行中であり、この技術の治療応用の可能性を示しています。
AAVを使用したウイルス遺伝子送達も、最近のFDAおよびEUの規制当局の承認が主要なマイルストーンとして、CNS疾患の臨床使用に急速に進んでいます。最後に、デザイナードラッグによって排他的に活性化されるデザイナー受容体(DREADD)などの化学遺伝学的受容体18は、トランスジェニックまたはトランスフェクトされた動物におけるニューロン興奮に対する薬理学的制御を提供するために神経科学者によって広く使用されています19,20。DREADDは、内因性リガンドではなく合成化学遺伝学的分子に応答するように遺伝子操作されたGタンパク質共役型受容体(GPCR)であり、これらのリガンドを全身投与すると、DREADD発現ニューロンの興奮性が増加または低下します。これら3つの技術をATACに組み合わせると、空間的、細胞型、時間的精度で選択された神経回路の非侵襲的変調に使用できます。
ここでは、単純な3Dプリントされたターゲティング装置を使用して、マウスのFUS-BBBOで脳領域を正確にターゲティングするための方法論を含めることにより、FUS-BBBO11 の以前に公開されたプロトコルを拡張および更新します。また、FUS-BBBOのATACへの応用についても紹介する。化学遺伝学的受容体を有するAAVの送達に必要なステップ、および組織学による遺伝子発現および神経調節の評価を示す。この技術は、遺伝子発現または神経調節のために大きなまたは複数の脳領域を標的とする場合に特に適用可能である。例えば、皮質の広い領域は、FUS-BBBOで容易に形質導入され、化学遺伝学を用いて調節され得る。しかしながら、代替技術である頭蓋内注射による遺伝子送達は、多数の侵襲的注射および開頭を必要とするであろう。FUS-BBBOとそのアプリケーションであるATACは、脳領域が大きく、侵襲的に標的とするのが難しいさまざまなサイズの動物にスケーリングできます。
ATACでは、正確なMRIガイド下ターゲティング、FUS-BBBO、遺伝子発現の組織学的評価など、特定の神経回路の神経調節を成功させるためのいくつかの技術の実装を成功させる必要があります。3Dプリント可能なコンポーネントは、イメージング誘導FUS-BBBOで小さな脳構造のターゲティングを簡素化するために開発されました。
MRIガイド下集束超音波(MRIgFUS)投与は、多くの課題をもたらします。まず、一般的なMRIコイルは、超音波ハードウェアではなく標本のみを収容するように設計された限られたスペースを持っています。MRIのより大きなボアは、信号がコイル32のフィルファクタに関連するので、機器のコストを増加させ、画質を低下させる。その結果、MRIで動物の画像の上部に配置されたFUSハードウェアは、画像品質を低下させます。第二に、MRI対応デバイスの設計は困難で費用がかかります。MRI対応材料は、反磁性であり、高周波照射時に渦電流が発生する傾向が低く、高磁場での磁化率が低い必要があります。導電性材料では、渦電流の発生またはその磁化率も画像品質に悪影響を及ぼします。最後に、利用可能なMRI互換材料は、固定装置フレームなどの精密ターゲティングマシンの製造に通常使用される金属よりもヤング率と耐久性が低くなっています。位置調整に使用されるモーターは、MRIに対応し、そのサイズのためにMRIボアの外側に配置する必要があります。これらのモーターは、MRI互換材料を使用して、MRIボア内のトランスデューサーに距離を置いて接続する必要があります。塑性反りの問題、堅牢なサイズのコンポーネントを実装するためのボア内の十分なスペースの欠如、および脳全体のターゲティング位置を変更するための不十分な余地が、以前の研究のターゲティング精度に影響を与えました。
これらの問題を解決するために、MRIでのイメージングとスキャナー外でのFUS-BBBO投与を行うことを決定しました。MRIガイダンスを可能にするために、マウスは、MRIとステレオタックス座標空間の両方でマウスの脳構造を局在化するために使用できるMRI可視ターゲティングガイドを備えた3Dプリントされた拘束具内に配置されました。マウスの頭蓋骨とターゲティングガイドの両方がイヤーバーホルダーにしっかりと取り付けられているため(図1a、b)、ターゲティングガイドを使用してMRI画像内の空間座標を相関させ、定位固定装置をゼロにすることができます。拘束装置には可動部品がなく、トランスデューサも含まれていないため、MRI内に収まる堅牢性と小型化を実現し、トランスデューサの電子機器からの信号干渉を排除しました。一部の材料の3DプリントされたサポートがMRIに表示されるため、ターゲティングガイド内のスペースはくり抜かれています(図1c)。定位固定装置キャリブレーションを可能にするために、アセンブリに穴が導入されました(図3)。超音波トランスデューサをステレオタックスの電極ホルダーに取り付け、セクション4(図1d)で説明したようにターゲティングを実行しました。トランスデューサーは、レベルプレーンからの逸脱を防ぐために、イヤーバーのハウジングによってその長さに沿って支持されるべきです。背腹方向のターゲティングは、環状アレイの位相シフトを使用して達成できます。
実用的なターゲティング精度は、超音波フォーカシングと頭蓋骨の減衰によって決まります。FUS−BBBO手順は、ラット11について詳細に記載されており、他の多くのモデル生物23、33、34およびヒト16、17において実施されている。超音波の焦点サイズの関係は周波数に反比例し、周波数が高いほどより正確な送達が可能になります。ただし、頭蓋骨の減衰は周波数35で増加し、頭蓋骨の加熱と皮質領域の損傷につながる可能性があります。正確なターゲティング戦略は、脳の部位によって異なります。全幅半最大圧力が脳組織内に収まる部位は、線条体、中脳、海馬などの多くの脳構造において予測可能で安全なBBB開口部を可能にする。脳の基部近くの領域は、マウスに特定の課題をもたらします。マウスの脳は背腹方向に約8〜10mmの大きさで、これは多くの市販のトランスデューサーの全幅半値サイズに匹敵します。その結果、頭蓋骨の底部を標的にすることは、外耳道、口、または気管に存在する骨および空気からの超音波反射をもたらし、高圧および低圧の予測不可能なパターンをもたらし得る36。これらの圧力のいくつかは、出血および組織損傷を引き起こすことが示されている慣性キャビテーション閾値を超える可能性がある37。頭蓋骨の基部近くに位置する領域を標的とするために、交差遺伝学38が、FUSビームで標的とされる領域よりも小さい領域に遺伝子発現を制限するために使用される交差ATAC7を使用することが好ましい場合がある。交差ATACの公表された例では、ドーパミン作動性細胞において遺伝子編集酵素(Cre38)を発現するトランスジェニック動物が、ドーパミン作動性細胞を含む領域のサブセクションにおいて超音波で標的化されている。最後に、皮質領域をFUSで標的にすることができますが、超音波の回折と反射が発生し、不均一な圧力プロファイルにつながる可能性があります。このプロトコルは、使用される種に大きく依存するため、皮質領域の標的化をカバーしていません。しかしながら、海馬7の上の皮質のいくらかの標的化(例えば、図7)が観察されており、少なくともマウスにおいて、可能であることを示す。
化学遺伝学的活性化剤の選択および投与量は、特定の実験的ニーズに依存する。著者の研究7の1つを含む多くの研究は、有意な非特異的反応を示さなかったが39,40、高用量(例えば、10 mg / kg)は、少なくとも場合によっては副作用を引き起こす可能性があります41。しかしながら、全ての行動実験と同様に、CNOおよびその代謝産物42の潜在的なオフターゲット活性のために、適切な対照31が不可欠である。このような対照には、DREADDを発現する動物へのCNOおよび生理食塩水対照の投与、および野生型動物へのCNOの投与、または特定の場合には、それぞれ化学遺伝学的受容体を発現する脳の同側部位と対側部位の比較が含まれます。さらに、最近の研究では、特異性が向上した多くの新しいDREADDアゴニストが明らかになりました28,29,43。他の化学遺伝学的受容体5、25、44もATAC手順と併せて使用することができる。
遺伝子発現の組織学的評価は、すべての動物について死後必要です。ごく一部の動物は、FUS-BBBO7後に遺伝子発現不良を示します。また、ミスターゲティングが可能なため、遺伝子発現の空間的精度や特異性を示す必要があります。注目すべきことに、一部のAAVは逆行性または順行性のトレース能力を示す可能性があり45 、正確な超音波ターゲティングにもかかわらず、超音波の標的部位から遠く離れたトランスフェクションを引き起こす可能性があります。発現された化学遺伝学的受容体がフルオロフォアに融合または共発現する場合、組織切片におけるフルオロフォアのイメージングは、局在および発現強度を評価するのに十分であり得る。しかし、多くの蛍光タンパク質は組織固定プロセスによって損傷を受けており、DREADDで頻繁に使用されるmCherryタンパク質の免疫染色は、以前の研究でより良いシグナルをもたらしました7。最後に、脳の特定の部分(海馬の顆粒状細胞層など)のニューロンの密度により、融合とは対照的に、IRES下で発現された核局在蛍光団を使用して細胞カウントを行うことは、核を容易にセグメント化し、DAPIやTO-PRO-3などの核染色で対比染色できるため、有益である可能性があります。c-Fos染色による神経調節を評価するには、核対比染色を行い、蛍光シグナルではなくc-Fos陽性核をカウントすることが不可欠です。場合によっては、細胞の破片が蛍光を示し、陽性細胞の測定値を混乱させる可能性があります。
FUS-BBBOによる薬物および遺伝子送達の限界には、侵襲的頭蓋内注射による送達よりも分解能が低いこと、および大量の注射薬物またはウイルスベクターが必要であることが含まれる。さらに、脳への直接注射は注射部位への排他的送達をもたらすが、FUS-BBBOは静脈内経路を使用するため、末梢組織への送達が可能である。神経調節のために化学遺伝学を使用することの制限には、遅いタイムスケールが含まれ、これは神経調節の強度の急速な変化を必要とするいくつかの行動プロトコルには不十分である可能性がある。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、Brain and Behavior Foundation, NARSAD Young Investigator Awardの支援を受けた。いくつかの3Dプリントされたコンポーネントは、もともとファビアン・ラビュソー(画像誘導療法、フランス)によって設計されました。著者は、原稿の準備に技術的な支援をしてくれたジョン・ヒース(カリフォルニア工科大学)とマーガレット・スウィフト(カリフォルニア工科大学)に感謝します。
21-gauge needles (BD) | Fisher Scientific | 14826C | |
25-gauge butterfly catheter | Harvard Bioscience | 725966 | |
30-gauge needles (BD) | Fisher Scientific | 14826F | |
Absorbent blue pad | Office Depot | 902406 | |
Anti-c-Fos antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-253-G | |
Anti-mCherry antibody | Thermofisher | PA534974 | |
Bruker Biospec 70/30 | Bruker | custom | includes the RF coils |
Clozapine-n-oxide | Tocris | 4936 | |
Custom designed 3D printed mouse harnesses and MRIgFUS targeting components | ImageGuidedTherapy, Szablowski lab | custom | download from szablowskilab.org/downloads |
Custom MRIgFUS machine | ImageGuidedTherapy | N/A | |
Definity microbubbles | Lantheus | DE4 | |
Degassed aquasonic/ultrasound gel | Fisher Scientific | 5067714 | |
Depilation crème | Nair | n/a | |
Eight-element annular array transducer | Imasonic Inc. | custom | |
Ethanol Pads/Alcohol Swabs (70%) (BD) | Office Depot | 599893 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-25KU | |
Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
Ketamine | Patterson Veterinary | 07-890-8598 | |
Neutral buffered formalin (10%) | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
Optical fiber hydrophone | Precision Acoustics | ||
PE10 tubing | Fisher Scientific | NC1513314 | |
Peristaltic pump | |||
Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 524650-1EA | |
Prohance contrast agent | Bracco | 0270-1111-04 | |
Saline | Fisher Scientific | NC9054335 | |
Secondary antibody, Donkey-anti goat | ThermoFisher | A-11055 | |
Secondary antibody, Donkey-anti rabbit | ThermoFisher | 84546 | |
Surgical scissors (straight) | Fisher Scientific | 17467480 | |
ThermoGuide Software | ImageGuidedTherapy | ||
Tissue glue (Gluture) | Fisher Scientific | NC9855218 | |
Tuberculin Syringe (1 mL) (BD) | Fisher Scientific | 14823434 | |
VeroClear 3D printable material | Stratasys | RGD810 | |
Vialmix microbubble activation device | Lantheus | VMIX | |
Vibrating microtome | Compresstome | VF-300 | |
Xylazine | Sigma-Aldrich | X1251-1G |