इसके साथ ही, हम गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल कैंसर में डीएनए मिथाइलेशन के जीनोम-वाइड विश्लेषण के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। प्रक्रिया अध्ययन के लिए प्रासंगिकता की है कि जीन के मिथाइलेशन पैटर्न और गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल कैंसर में कैंसरजनन के लिए योगदान कारकों के बीच संबंधों की जांच ।
डीएनए मिथाइलेशन एक महत्वपूर्ण एपिजेनेटिक परिवर्तन है जो जैविक रूप से सार्थक है और कैंसर अनुसंधान का लगातार ध्यान केंद्रित करता है। जीनोम-वाइड डीएनए मिथाइलेशन गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल (जीआई) घातक की मिथाइलेशन स्थिति का सटीक विश्लेषण प्रदान करने के लिए एक उपयोगी उपाय है। डीएनए मिथाइलेशन विश्लेषण के कई संभावित अनुवादात्मक उपयोगों को देखते हुए, चिकित्सकों और डीएनए मिथाइलेशन अध्ययनों के लिए नए दूसरों का अभ्यास करने के लिए कदम से कदम समझने में सक्षम होने की जरूरत है कि कैसे इन जीनोम व्यापक विश्लेषण किया जाता है । इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य इस बात का विस्तृत विवरण प्रदान करना है कि जीआई घातक में बायोमार्कर पहचान के लिए इस विधि का उपयोग कैसे किया जाता है। महत्वपूर्ण बात, हम तीन महत्वपूर्ण चरणों का वर्णन करते हैं जो जीनोम-व्यापी विश्लेषण के दौरान सटीक परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं। स्पष्ट रूप से और संक्षिप्त लिखा है, इन तीन तरीकों अक्सर कमी है और एपिजेनेटिक अध्ययन के लिए उन नए करने के लिए ध्यान देने योग्य नहीं हैं । हमने जीआई द्रोह (गैस्ट्रिक कैंसर) के 48 नमूनों का उपयोग व्यावहारिक रूप से उजागर करने के लिए किया कि जीआई घातक के लिए जीनोम-वाइड डीएनए मिथाइलेशन विश्लेषण कैसे किया जा सकता है।
एपिजेनेटिक्स डीएनए1के अनुक्रम में परिवर्तन किए बिना जीन कार्य में वंशानुगत परिवर्तनों को संदर्भित करता है । इस तरह के बदलाव डीएनए मिथाइलेशन के कारण हो सकते हैं, जिसमें डीएनए बेस पर मिथाइल ग्रुप क्रोमेटिन पैकिंग में बदलाव के जरिए जीन एक्सप्रेशन को बदल सकते हैं । कैंसर का विकास और प्रगति हो सकती है यदि इस प्रभाव के परिणामस्वरूप ट्यूमर दबाने वाले जीन की अभिव्यक्ति बदल जाती है2. उम्र बढ़ने और पुरानी सूजन कैंसर के कारण हैं और मनुष्यों में डीएनए मिथाइलेशन में परिवर्तन के मुख्य कारणहैं 3,4,5. नतीजतन, यह कैंसर निदान में एक बायोमार्कर के रूप में डीएनए मिथाइलेशन के उपयोग की अनुमति देता है, और उपचार और रोकथाम के लिए एक लक्ष्य के रूप में। जल्दी पता लगाने और कैंसर रोग का निदान करने के लिए, डीएनए मिथाइलेशन ट्यूमर, रक्त, मूत्र, और मल के नमूनों में मापा जा रहा है6,जबकि demethylating एजेंटों अब इस तरह के myelodysplastic सिंड्रोम7के रूप में ल्यूकेमिया के इलाज के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है ।
जीनोम-वाइड डीएनए मिथाइलेशन विश्लेषण मानव जीनोम में एक व्यक्ति सीपीजी लोकस में डीएनए मिथाइलेशन के जटिल मूल्यांकन के लिए एक सरणी मंच का उपयोग जीनोम डीएनए8,9में 450,000 से अधिक सीपीजी साइटों की मिथाइलेशन स्थिति की जांच करने के लिए किया जा सकता है, जो कैंसर एपिजेनेटिक्स की खोज की अनुमति देता है (सामग्री की तालिकादेखें)। संपूर्ण जीनोम बिसल्फी अनुक्रमण (डब्ल्यूजीबीएस) प्रौद्योगिकियों ने एपिजेनेटिक्स10,11के क्षेत्र में हमारे दृष्टिकोण को बदल दिया है। हालांकि,10,11नमूनों की एक बड़ी संख्या के एपीजेनेटिक विश्लेषण के लिए पर्याप्त लागत और प्रसंस्करण समय के संदर्भ में प्रौद्योगिकियों के लिए कुछ नुकसान हैं। इसलिए, मानव जीनोम में डीएनए मिथाइलेशन के जटिल मूल्यांकन के लिए सरणी मंच अधिक व्यवहार्य है। जीनोम-व्यापी मिथाइलेशन विश्लेषणों के लिए दृष्टिकोणों की उपलब्धता में पिछले कुछ वर्षों में सुधार हुआ है और हमें अपने ज्ञान का विस्तार करने की अनुमति देता है कि डीएनए मिथाइलेशन कैंसर के विकास और प्रगति12में कैसे योगदान देता है । माइक्रोएरे-प्लेटफ़ॉर्म दृष्टिकोणों में हाल की प्रगति हमें गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल कैंसर13में एक उपन्यास एपिजेनेटिक हस्ताक्षर की पहचान करने के लिए जीनोम-वाइड मिथाइलेशन विश्लेषण का औचित्य प्रदान करती है। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य इस बात का विस्तृत विवरण प्रदान करना है कि जीआई घातक में बायोमार्कर पहचान के लिए इस विधि का उपयोग कैसे किया जाता है।
डीएनए मिथाइलेशन जीनोम-वाइड विश्लेषण से सटीक परिणाम प्राप्त करने में तीन महत्वपूर्ण कदम हैं । पहला प्रतिनिधि एच एंड ई दाग वर्गों के आधार पर अधिमानतः दो योग्य रोगविज्ञानियों द्वारा ट्यूमर क्षेत्र का मैक्रोडिसेक्शन है। गलत मैक्रोडिसेक्शन आसन्न गैर-कैंसर ऊतकों के साथ संदूषण का कारण बन सकता है, जो अविश्वसनीय परिणाम पैदा करता है; इस प्रकार, सावधान मैक्रोडिसेक्शन की आवश्यकता है। दूसरा डीएनए गुणवत्ता का आकलन है (गुणवत्ता की जांच: QC) । क्यूसी (∆सीक्यू और 5.0) को विफल करने वाले नमूने खराब गुणवत्ता वाले आंकड़े दे सकते हैं। इसलिए, ∆Cq और gt; 5.0 वाले नमूनों को हटाया जाना चाहिए और अन्य का उपयोग किया जाना चाहिए। तीसरा चरण β-मूल्य की गणना है, जो ऐरे प्लेटफॉर्म सॉफ्टवेयर के लिए एक डेटा विश्लेषण उपकरण द्वारा मेथिलेटेड सिग्नल/कुल (मिथाइलेटेड + अनमेथाइलेटेड) सिग्नल17के रूप में निर्धारित किया जाता है। β-मूल्य 0-1 (या 0%-100%) से होता है, जो जैविक रूप से17की व्याख्या करना सरल है। इस मूल्य के साथ मुख्य समस्या इसकी खराब सांख्यिकीय गुण है, क्योंकि इसकी उच्च विषमता का तात्पर्य है कि मिथाइलेशन रेंज चरम सीमा (β = 0 या β = 1) पर नमूनों में भिन्नता17को अत्यधिक कम कर दी गई है। इसके अलावा, खराब नमूना गुणवत्ता के कारण, β-मान प्रजनन योग्य बिफेसिक चोटियों22नहीं दिखा सकते हैं, और ऐसी चोटियों के बिना नमूनों को आगे के अध्ययन से बाहर रखा जाना चाहिए। इसके अलावा, बड़े बीटा मूल्यों होने, प्रमोटर क्षेत्र में सीपीजी द्वीपों से संबंधित होने और क्यूएमएसपी के लिए प्राइमर और जांच डिजाइन के लिए उपयुक्त होने के मापदंड के आधार पर लक्ष्य जीन चुना जाना चाहिए ।
मानव जीनोम में सीपीजी लोकस में डीएनए मिथाइलेशन का मूल्यांकन माइक्रोएरी-आधारित प्रौद्योगिकी का उपयोग करके किया जाता है जिसमें विशिष्ट जीनोमिक लोकी का सर्वेक्षण करने के लिए जांच की एक निश्चित संख्या होती है। यह एपिगेनोम-वाइड एसोसिएशन अध्ययन (ईडब्ल्यूएएस) में सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है, इसकी कम लागत, डीएनए की छोटी मात्रा और स्पष्ट रूप से कम नमूना प्रसंस्करण समय के कारण, जो कई नैदानिक नमूनों23के उच्च-थ्रूपुट प्रसंस्करण की अनुमति देता है। हालांकि, एक व्यक्तिगत सीपीजी लोकस में डीएनए मिथाइलेशन के जटिल मूल्यांकन के लिए एक सरणी मंच एपिले आनुवंशिक रूप से परिवर्तित लोकी के लिए जांच की संख्या और विशिष्टता से सीमित है, जो कुछ जीनोमिक क्षेत्रों की खोज को रोकता है। डब्ल्यूजीबीएस को आम तौर पर जीनोमिक कवरेज10 , 11के व्यापक स्पेक्ट्रम के कारण सोने के मानक विधि के रूप मेंदेखा जाताहै । हालांकि, इस विधि में10 , 11नमूनों की बड़ी संख्या के विश्लेषण के लिए पर्याप्त लागत और अपेक्षाकृत लंबी प्रसंस्करण समयहै। इस प्रकार, यह हमेशा संभव नहीं है। इसकी तुलना में, मानव जीनोम में एक व्यक्तिगत सीपीजी लोकस में डीएनए मिथाइलेशन के जटिल मूल्यांकन के लिए सरणी मंच लागत और जीनोमिक कवरेज के मामले में उपयोग के लिए उचित है। हाल ही में, नवीनतम उन्नत मनका चिप्स24का उपयोग करने के लिए तैयार हो गया है । ये परख हमें लगभग दोगुनी मापी गई सीपीजी साइटों का विश्लेषण करने में मदद कर सकती हैं, जो बड़े नमूना आबादी के लिए आदर्श जीनोम-वाइड एसोसिएशन अध्ययन (जीडब्ल्यूएएस) प्राप्त कर सकती हैं।
संक्षेप में, मानव जीनोम में एक व्यक्तिगत सीपीजी लोकस में डीएनए मिथाइलेशन के जटिल मूल्यांकन के लिए सरणी मंच के साथ डीएनए मिथाइलेशन जीनोम-वाइड विश्लेषण गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल कैंसर में एपिजेनेटिक बायोमार्कर पर महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकता है। WGBS के साथ तुलना में, यह विधि लागत प्रभावी है और नमूना प्रसंस्करण समय कम कर देता है । इसलिए, सीपीजी लोकस में डीएनए मिथाइलेशन का पता लगाने के लिए इस विधि का व्यापक रूप से एपिजेनेटिक बायोमार्कर अनुसंधान में उपयोग किए जाने की संभावना है।
The authors have nothing to disclose.
हम विशेष रूप से सर्जरी विभाग के सभी सदस्यों के लिए आभारी हैं, सिडनी Kimmel व्यापक कैंसर केंद्र जॉन्स हॉपकिंस विश्वविद्यालय के स्कूल ऑफ मेडिसिन में उपयोगी चर्चा और तकनीकी सहायता के लिए । हम क्रिस्टेन रोजर्स को बिसुल्फिट उपचार और क्यूएमएसपी के लिए प्रक्रियाओं पर उदार तकनीकी मार्गदर्शन के लिए भी धन्यवाद देते हैं।
(NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | 14148 | Step 5.2. |
10% Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Quality Biological | 351-032-721 EA | Step 2.1. |
100 % Ethanol | Sigma-Aldrich | 24194 | Step 1.7. |
ABI StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied BioSystems | 4376600 | Step 5.2. 96-well Real-Time PCR instrument |
CT conversion reagent | Zymo Research | D5001-1 | Step 3.2.3. |
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) | Invitrogen | 10297-018 | Step 5.2. |
DEPC-treated water | Quality Biological | 351-068-131 | Step 2.1. |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Corning | 46-034-CL | Step 2.1. |
EZ DNA Methylation Kit | Zymo Research | D5002 | Step 3.2. |
Fluorescein | Bio-Rad | #1708780 | Step 5.2. |
GenomeStudio | omicX | OMICS_00854 | Step 4.3. Data analysis tool for an array platform as a β-value, with a range from 0 to 1 |
Human genomic DNA | New England Bio Labs | N4002S | Step 5.3. |
Infinium HD FFPE QC Kit | Illumina | WG-321-1001 | Step 4.1. FFPE QC assay on a real-time PCR amplification |
Infinium HumanMethylation450 assay | Illumina | WG-314 | Step 4.2. Array platform for complex evaluation of DNA methylation to assess the methylation status of >450,000 CpG sites in the genome |
LightCycler 480 | Roche | 5015278001 | Step 4.1. |
M-Binding Buffer | Zymo Research | D5002-3 | Step 3.2.6. |
M-Desulphonation Buffer | Zymo Research | D5002-5 | Step 3.2.9. |
M-Dilution Buffer | Zymo Research | D5002-2 | Step 3.2.1. |
Minfi package | Bioconductor | N/A | Step 4.4. |
M-Wash Buffer | Zymo Research | D5002-4 | Step 3.2.10. |
Platinum Taq polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966-034 | Step 5.2. |
Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | Step 2.8. |
Single-use polypropylene (Eppendorf) tube | Eppendorf | 24533495 | Step 2.5.2. |
Tris hydrochloride (Tris-HCL) 2 M pH 8.8 | Quality Biological | 351-092-101 | Step 2.1. |
Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | Step 1.3. |
Zymo Spin 1 Column | Zymo Research | C1003 | Step 3.2.6. |
β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Step 5.2. |