在这项工作中,我们提供了一种用抗体对磁性纳米材料进行生物功能化的方案,用于特定的细胞靶向。例如,我们利用铁纳米线来靶向癌细胞。
磁性纳米材料在不同的生物医学应用中受到广泛关注。用特定的靶向剂对这些纳米材料进行生物功能化是提高其诊断和治疗疗效,同时最大限度地减少副作用的关键方面。与非磁性纳米材料相比,磁性纳米材料的优势在于它们能够以非接触方式和远距离响应磁场。这允许引导或积累它们,同时也可以监控它们。最近,具有独特功能的磁性纳米线(NWs)被开发用于生物医学应用。这些NW的大磁矩可以通过磁场更有效地远程控制它们的运动。这已在癌症治疗、药物递送、细胞示踪、干细胞分化或磁共振成像中取得了巨大成功。此外,通过模板辅助电化学沉积进行NW制造提供了一种通用的方法,可以严格控制NW特性。特别是铁纳米管和铁-铁-氧化铁(核壳)纳米管由于其高磁化强度和低毒性而适用于生物医学应用。
在这项工作中,我们提供了一种使用针对在大量癌细胞中过表达的特定细胞表面标志物的特异性抗体对铁/氧化铁 NW 进行生物功能化的方法。由于该方法利用了氧化铁表面的特性,因此也适用于超顺磁性氧化铁纳米颗粒。NW 首先涂有 3-氨丙基-三乙氧基-硅烷 (APTES) 作为连接子,抗体共价连接到该连接子上。APTES包被和抗体的生物功能化通过电子能量损失谱(EELS)和zeta电位测量得到证实。此外,使用免疫沉淀和蛋白质印迹法测试NWs上抗体的抗原性。通过共聚焦显微镜和细胞活力测定研究了生物功能化NWs的特异性靶向及其生物相容性。
磁性纳米材料的一个独特特性是它们对磁场的响应能力1,可以有效地利用磁场以多种方式驱动它们,同时它们也可以通过磁共振成像 (MRI) 等进行监测。当施加高频交变磁场时,它们会产生热量,从而诱发体温过高,从而提供治疗选择1。另一种方法是光热处理,可以使用近红外 (NIR) 激光 2,3 实现。
在众多磁性纳米材料中,氧化铁在磁分离、热疗2,4、细胞引导5、药物递送6,7,8以及作为MRI造影剂9,10等生物应用中最受关注。这是由于它们的高生物相容性 11,12、大磁化强度 11,12、包被能力9、13、14、15、携带药物的能力 2,16、药物功能化的能力2,16 或/和靶向剂12,13,17,18,以及将光能转化为热的能力2.最近,MagForce开始使用氧化铁纳米颗粒进行热疗治疗的癌症患者临床试验19。
最近,磁性纳米线 (NW) 越来越多地用于生物医学应用 3,11,16,20,21,22。它们具有与磁性纳米珠相似的特性,但具有各向异性的形状和非常大的磁矩,这使得通过磁场23,24 进行非常有效的远程控制,包括低频驱动以诱导磁机械效应 25,26,27,28,29 .因此,NW已被用于不同的生物学应用,例如外泌体分离30细胞追踪21,癌症治疗3,11,16,药物递送16,31,32,以及作为MRI造影剂33。
具有特定细胞靶向能力的生物功能化磁性纳米材料在生物医学应用和精准医学方面具有巨大潜力34,35。为了附着这些靶向剂,需要对纳米材料进行表面改性。通常,它们需要一种提供官能团的涂层,这有利于处理剂的附着。在文献中,有大量的磁性纳米材料有机和无机涂层。根据可以固定在纳米材料上的官能团,这些涂层可分为四大类:基于羧酸基团的分子、聚合物、组氨酸和基于硅烷基团的分子。
基于羧酸基团的分子是表面改性方法之一。它利用高亲和力
在涂层上的负羧酸基团和磁性纳米材料上的正电荷之间36,37,38。羧酸与金属表面的结合过程可能涉及金属羧酸盐的产生或羧基与金属的粘附。然而,对于多段NWs,如铁/金或镍/金NWs,它们在生物应用方面具有极好的性能39,40,这种类型的涂层不容易应用。它需要同时使用两种不同的涂层:用于修饰金段的硫醇基团和用于磁段(铁或镍)的羧基38。基于羧基的分子的一些例子是血卟啉、庚二酸、棕榈酸和 3-[(2-氨基乙基)二硫代] 丙酸 (AEDP)38。使用聚合物对磁性纳米材料进行表面改性具有一些明显的优势。由于聚合物的大分子量,它增强了磁性纳米材料在溶液38中的稳定性。然而,它将显著增加纳米材料38的尺寸。聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)、聚乙烯亚胺 (PEI)、精氨酸-甘氨酸-D 天冬氨酸 (RGD) 和聚乙二醇 (PEG) 是最常用的表面改性聚合物的一些例子。每个都有自己的功能并使用38。第三种表面改性方法是使用组氨酸涂层。组氨酸是一种具有组氨酸氨基酸侧链的蛋白质,对有限数量的磁性纳米材料(如镍38)具有高亲和力。它可用于蛋白质纯化过程38,41,42。组氨酸涂层也可以应用于多段NWs,例如镍/金NWs38。纳米材料表面的硅烷化是一个成熟的过程38,43,44。它基于一个硅原子通过三个单键与任何金属氧化物表面连接,同时该硅原子通过烷基链38,43,44与末端的官能团结合。这种涂层的优点是提供游离胺基团,并且它能够分别涂覆磁性和非磁性材料38,45,例如镍和金。因此,使用基于盐水基团的分子是生物功能化多链段NWs的实用途径。基于硅烷基团的分子的一些例子是(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(APTES)和(3-氨丙基)三甲氧基硅烷(APTMS)38,45。
在涂层中添加靶向剂可以在病变细胞的诊断和治疗中发挥重要作用,同时最大限度地减少对健康组织的副作用46,47。在纳米材料表面添加靶向剂可增强细胞选择性结合和通过内吞受体的内化7。如果没有这些靶向配体,纳米材料会与细胞膜发生非特异性相互作用,与具有配体的纳米材料相比,细胞膜的结合速率较低48。靶向癌组织的挑战之一是它们与健康组织的特征相似性。因此,靶向的成功主要取决于确定用作生物靶标的适当配体49,50。各种靶向剂已被用于将纳米材料引导至癌细胞48,51(例如,CD44,因为它在癌细胞中的高表达与健康细胞相比 52,53,54,55)。
靶向药物可根据其成分及其复杂性分为三大类:基于适配体的靶向、基于配体的靶向和基于抗体的靶向。适配体是化学合成的短链 DNA 或 RNA-寡核苷酸,折叠成二维和三维结构,使其能够靶向特定抗原,最常见的是蛋白质56。基于配体的靶向包括肽和短氨基酸链57。基于抗体的靶向涉及使用整个抗体或抗体片段,例如单链可变片段或抗原结合片段51。使用这种方法的优点是具有两个与其特异性靶抗原具有高结合亲和力的结合位点,这使其具有极高的选择性58。结合位点类似于锁,抗原类似于钥匙58。
在这项工作中,使用的NW是通过电沉积到氧化铝膜上来制造的,这种方法在以前的出版物59中进行了详细描述。这里的重点是从膜中释放这些铁-氧化铁(核壳)NW,并用特异性抗体对它们进行生物功能化,以提供靶向能力。抗体不能直接与氧化铁-氧化铁NWs结合,需要连接子。用APTES包被NWs可提供游离胺基团,从而通过抗体上的羧基实现共价连接(图1)。APTES 涂层的优点是它能够同时适用于磁性21 和非磁性60 材料,例如铁/金或镍/金 NWs45。通常,该协议中解释的所有涂层和生物功能化步骤都可以与任何铁/氧化铁纳米材料一起使用。这里以铁/氧化铁NW为例。结果表明,抗体功能化的NWs对特异性细胞表面受体具有较高的抗原性,可用于不同的应用。示例包括细胞分离、药物递送、使用光热和/或磁机械处理的特定癌细胞治疗。
与任何纳米材料制造和涂层方法一样,需要高质量的解决方案。释放(1 M NaOH)和官能化(MES)溶液可以重复使用多次。然而,在开始新工艺之前检查它们的pH值非常重要。在释放步骤中,用NaOH洗涤NW应至少进行四次。洗涤效果越好,NW的稳定性越好,它们的聚集度就越少。氧化层增强了NWs浸入乙醇或水中时的稳定性63。
用APTES和抗体包被NW后,NW的直径和长度受到影响。在这里,直径从 41.5 nm 增加到 70 nm,长度从 2.5 μm 减少到 1.6 μm,这是由于超声处理步骤破坏了 NW。因此,在生物功能化步骤之后表征NWs的形态至关重要。
抗体与NWs的结合依赖于胺基(在APTES上)和羧基(在抗体上)之间的共价相互作用。因此,确认APTES涂层的存在是一个重要的步骤,为此我们使用了EELS映射。涂层方法安全直接。它不需要高温或较长的孵育时间。此外,APTES涂层还可作为连接剂,使具有羧基的其他抗体或蛋白质实现共价连接。
在用抗体对NW进行生物功能化的情况下,生物功能化过程后抗体结合位点的抗原性可能会受到影响。IP 和 WB 方法可用于调查此问题。使用本协议中提到的生物功能化方法将允许抗体与对特定细胞受体具有高抗原性的NW结合。此外,用抗体对 NW 进行生物功能化增加了用目标受体 CD44 靶向细胞的能力。共聚焦显微镜证实了这一点。尽管未包被NWs的生物相容性很高(>95%),但向NWs添加APTES包被或抗体可提高其100%的生物相容性。
此外,包被和生物功能化方案是高效、经济和可重复的。它应该适用于任何其他铁-氧化铁纳米材料,因此应根据纳米材料的表面积和质量优化涂层和附着抗体的浓度。该协议可以在一般实验室的环境条件下安全地完成。生物功能化显著增强了纳米材料的生物相容性和靶向能力。总的来说,NW是纳米医学应用(包括多模态或组合治疗、细胞检测或引导以及生物传感)的非常有前途的材料。结合生物功能化,如本文所述,可以实现特异性细胞靶向,以提高精度和功效。
The authors have nothing to disclose.
本出版物中报告的研究得到了阿卜杜拉国王科技大学(KAUST)的支持。
2 mL tube (snap-cap Microcentrifuge) | Eppendorf, Fisherscientific | 05-402-7 | |
2-N-Morpholino EthaneSulfonic acid hydrate 99% (MES) | Thermscientific | AC172590250 | Concentration 0.1 M and pH 4.7 |
3-3-Dimethyl-aminopropyl Carbodiimide (EDC) | Thermofisher | PG82079 | |
3-AminoPropyl-Tri-Ethoxy-Silane (APTES) | Sigma Aldrich | 919302 | |
5 mL glass tube | Fisherscientific | 03-339-22C | |
96-well plate ( flat bottom) | Sigma Aldrich | CLS3595 | |
Anti-CD44 antibody | BD Biosciences | 550990 | Clone 515, concentration 1 mg/mL |
APTES ((3-Aminopropyl)triethoxysilane), 99% | Sigma Aldrich | 919-30-2 | Concentration 99% |
BCA assay (Pierce BCA Protein Assay Kit) | Thermofisher | 23225 | |
Bovine Serum Albumin solution (BSA) | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Concentration 35% |
Cell incubator | Thermofisher | 50116047 | |
Cell viability reagent | AlamarBlue,Thermofisher | DAL1025 | |
Colon cancer cells – HCT116 cell line | ATCC | 430641 | |
Hardwood Hammer | Any hammer tool can be used, there is no specific brand. | ||
Inductively coupled plasma Mass Spectrometer (ICP-MS) | Perkin Elmer | ELAN 9000 ICP-MS | The used software is "Elan instrument control session" |
Laboratory Retort Stand with Clamp | RVFM | 13-0140 | This is used to handle the 5 mL glass tube in the sonicator bath. |
Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) | Thermofisher | 12321D | |
McCoy’s 5A Medium 1x | Gibco | 16600082 | |
Microplate reader (Bio-Rad xMark Absorbance Spectrophotometer) | Bio-Rad | 1681150 | Microplate Manager 6 software (#168-9520) |
Phosphate buffered saline (PBS) 10x | Gibco | 14200067 | Concentration 0.1 M (No calcuim, no magnesium) |
Phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 14190136 | Concentration 0.01 M (No calcuim, no magnesium) |
Plate shaker (Microplate Genie) | Scientific Industries (Genie) | SI-0400 | |
Single Edge Razor blades | Polysciences | 08410-1 | |
Sodum hydrixide (NaOH) | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | Concentration 1 M, pH 13 |
Sulfo-N-HydroxySulfosuccinimide (sulfo-NHS) | Thermofisher | 106627-54-7 | |
Trypsin | ATCC | 30-2101 | |
Tube rotator | VWR | 10136-084 | |
Tube shaker (Eppendorf Thermomixer R Mixer, 2.0 mL) | Eppendorf, Fisherscientific | 05-400-204 | |
Ultrasonic bath (2510) | Branson | 2489502 |