Live-Cell Forward Genetische Benadering voor identificeren en isoleren developmental mutanten in Chlamydia trachomatis
Summary
Dit protocol maakt gebruik van fluorescerende promotor-verslaggevers, live-cel microscopie, en individuele opname extractie in een gerichte voorwaartse genetische benadering te identificeren en isoleren van ontwikkelingsmutanten van Chlamydia trachomatis.
Abstract
De intracellulaire bacteriële ziekteverwekker Chlamydia trachomatis ondergaat een ontwikkelingscyclus bestaande uit twee morfologisch discrete ontwikkelingsvormen. Het niet-replicante elementaire lichaam (EB) initieert infectie van de gastheer. Eenmaal binnen onderscheidt de EB zich in het reticulerende lichaam (RB). De RB ondergaat vervolgens meerdere replicatierondes, voordat het zich onderscheidt van de besmettelijke EB-vorm. Deze cyclus is essentieel voor chlamydial overleving als het niet schakelen tussen celtypen voorkomt dat gastheer invasie of replicatie.
Beperkingen in genetische technieken als gevolg van de obligate intracellulaire aard van Chlamydia hebben belemmerd identificatie van de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de cel-type ontwikkeling. We ontwierpen een nieuwe dual promoter-reporter plasmid systeem dat, in combinatie met live-cel microscopie, zorgt voor de visualisatie van celtype schakelen in real time. Om genen te identificeren die betrokken zijn bij de regulering van de ontwikkeling van het celtype, werd het live-cel promotor-reporter systeem ingezet voor de ontwikkeling van een voorwaartse genetische benadering door chemische mutagenese van de dubbele reporter stam, beeldvorming en tracking van Chlamydia te combineren met veranderde ontwikkelingskinetiek, gevolgd door kloonisolatie van mutanten. Deze voorwaartse genetische workflow is een flexibel instrument dat kan worden aangepast voor gerichte ondervraging in een breed scala van genetische trajecten.
Introduction
Chlamydia trachomatis (Ctr) is een obligate intracellulaire ziekteverwekker die vordert door middel van een bifasische ontwikkelingscyclus die essentieel is voor zijn voortbestaan en proliferatie1. Deze cyclus bestaat uit twee ontwikkelingsvormen, het elementaire lichaam (EB) en het reticulate lichaam (RB). De EB is replicatie incompetent, maar bemiddelt celinvasie door middel van effector geïnduceerde endocytose2. Eenmaal in de gastheer, de EB rijpt om de replicative RB. De RB voert meerdere rondes van replicatie voorafgaand aan het omzetten terug naar de EB om latere rondes van infectie te starten.
De beperkte reeks van genetische hulpmiddelen heeft beperkt het grootste deel van het chlamydial onderzoek tot biochemische studies of het gebruik van surrogaatsystemen. Als gevolg daarvan was de opheldering van de genregulatie en de controle van de ontwikkelingscyclus moeilijk3,4. Een van de belangrijkste uitdagingen op chlamydial gebied is de hoge resolutie temporele tracking van de chlamydial ontwikkelingscyclus en de identificatie van de eiwitten die betrokken zijn bij de regelgeving. Genexpressie tijdens de chlamydial ontwikkelingscyclus wordt traditioneel uitgevoerd door destructieve “eindpunt”-methoden, waaronder RNAseq, qPCR en vaste celmicroscopie5,6. Hoewel deze methoden waardevolle informatie hebben verstrekt, zijn de gebruikte technieken moeizaam en hebben ze een lage temporele resolutie5,6.
In het afgelopen decennium is de genetische manipulatie van Ctr gevorderd met de invoering van plasmidetransformatie en methoden voor mutagenesis7,8,9. Voor deze studie werd een plasmidengebaseerd systeem ontwikkeld om de chlamydial ontwikkeling in individuele insluitsels in real time in de loop van een infectie te monitoren. Er werd een chlamydial transformant gecreëerd die zowel een RB als een EB-celtype specifieke promotor-reporter uitdrukte. De RB specifieke verslaggever werd gebouwd door het fuseren van de promotor van de vroege RB gen euo stroomopwaarts van het fluorescerende eiwit Clover. EUO is een transcriptie regulator die onderdrukt een subset van late EB geassocieerde genen10. De promotor van hctB, die codeert een histone-achtige eiwit betrokken bij EB nucleoïde condensatie, werd gekloond direct stroomopwaarts van mKate2 (RFP) om de EB specifieke verslaggever11te creëren . De ruggengraat voor hctBprom-mKate2/euoprom-Clover was p2TK2SW27. De hctB en euo promotors werden versterkt uit Ctr-L2 genomic DNA. Elke promotor sequentie bestond uit ~ 100 basisparen stroomopwaarts van de voorspelde transcriptie startplaats voor het opgegeven chlamydial gen plus de eerste 30 nucleotide (10 aminozuren) van de respectieve ORF. De fluorescerende FP varianten werden commercieel verkregen als Ctr codon geoptimaliseerde genblokken en gekloond in frame met de eerste 30 nucleotide van elk chlamydial gen en promotor. De incD terminator werd gekloond direct stroomafwaarts van mKate2. De tweede promotor-verslaggever werd ingevoegd stroomafwaarts van de incD terminator. Het ampicilline resistentiegen(bla)in p2TK2SW2 werd vervangen door het aadA-gen (Spectinomycin resistance) van pBam4. Dit resulteerde in de uiteindelijke construct p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover (Figuur 1A) die werd omgezet in Ctr-L27. Deze RB/EB reporter stam zorgde voor de observatie van de ontwikkelingscyclus binnen enkele insluitsels met behulp van live-cel microscopie (figuur 1B,C).
Met behulp van onze promotor-reporter constructie in combinatie met chemische mutagenese, werd een protocol bedacht om individuele klonen te volgen en te isoleren die ontwikkelingsafwijkingen vertoonden van gemutagenized populaties van Ctr serovar L2. Dit protocol maakt het mogelijk voor de directe monitoring van individuele chlamydia-opnemingen, het bijhouden van de genexpressieprofielen in de tijd, het identificeren van chlamydia klonen die een veranderd ontwikkelingsgenexpressiepatroon uitdrukken, en kloonisolatie van Chlamydia van individuele insluitsels.
Hoewel dit protocol speciaal is gemaakt voor de identificatie van genen die betrokken zijn bij chlamydial ontwikkeling, kan het gemakkelijk worden aangepast om een willekeurig aantal chlamydial genetische trajecten te ondervragen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het ontleden van de mechanismen die de chlamydial ontwikkelingscyclus controleren is belemmerd door de beperkingen van de momenteel beschikbare genetische hulpmiddelen. In dienst van onze promotor-reporter Chlamydia in combinatie met live-cel geautomatiseerde microscopie, werd een systeem gebouwd dat het mogelijk maakt monitoring van cel-type ontwikkeling in individuele insluitsels over een periode van 24 uur. Dit systeem, in combinatie met chemische mutagenese en directe inclusieisolatie, heeft een methode ontw…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr. Anders Omsland van de Washington State University voor het leveren van de CIP-1 axenic media. Dit werk werd ondersteund door NIH grant R01AI130072, R21AI135691 en R21AI113617. Aanvullende ondersteuning werd geboden door startkapitaal van de Universiteit van Idaho en het Center for Modeling Complex Interactions via hun NIH-subsidie P20GM104420.
Materials
| 24-well polystyrene plates | Corning | 3524 | Cell culture growth for reinfection of isolates |
| 6-well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | Cell culture growth for imaging |
| 96-well glass bottom plates | Nunc | 165305 | Cell culture growth for imaging |
| Bold line CO2 Unit | OKO Labs | CO2 UNIT BL | Stage incubator CO2 control |
| Bold line T Unit | OKO Labs | H301-T-UNIT-BL-PLUS | Stage incubator temperature control |
| Borosilicate glass capillary tubes | Sutter Instrument | B1005010 | Capillary tubes |
| BrightLine bandpass emissions filter (514/30nm) | Semrock | FF01-514/30-25 | Fluoescent filter cube |
| BrightLine bandpass emissions filter (641/75nm) | Semrock | FF02-641/75-25 | Fluoescent filter cube |
| CellTram Vario | Eppendorf | 5196000030 | Microinjector |
| Chlamydia trachmatis serovar L2 | ATCC | VR-577 | Chlamydia trachomatis |
| CIP-1 media | In house | NA | Axenic media. IPB supplemented with 1% FBS, 25 μM amino acids, 0.5 mM G6P, 1.0 mM ATP, 0.5 mM DTT, and 50 μM GTP, UTP, and CTP. (Omsland, A. 2012) made in-house. |
| Cos-7 cells (ATCC) | ATCC | CRL-1651 | African green monkey kidney cell (host cells) |
| Cycloheximide | MP Biomedicals | 194527 | Host cell growth inhibitor |
| Ethyl methanesulfonate, 99% | Acros Organics | AC205260100 | Mutagen |
| Fetal Plex | Gemini Bio-Products | 100-602 | Supplement for base growth media |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/Fiji | NA | Open sourse Image analysis software. https://imagej.net/Fiji |
| Galaxy 170 S CO2 incubator | Eppendorf | CO1700100X | Cell culture incubation |
| gblocks (Fluorescent FP variants: Clover and mKate2) | Integrated DNA Technologies | NA | gblock ORFs of Ctr optimized FP varients for cloning into p2TK2SW2 |
| Gentamycin 10mg/ml | Gibco | 15710-064 | Antibiotic for growth media |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Corning | 21-020-CM | Host cells rinse |
| Heparin sodium | Amersham Life Science | 16920 | inhibits and reverses the early electrostatic interactions between the host cell and EBs |
| HEPES 1M | GE Life Sciences | SH30237.01 | pH buffer for growth media |
| InjectMan | Eppendorf | 5179 000.018 | Micromanipulator |
| Jupyter Notebook | https://jupyter.org/ | NA | Visualization of inclusion traces. https://jupyter.org/ |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | LB10-3 | Filter wheel controler |
| Oko Touch | OKO Labs | Oko Touch | Interface to control the Bold line T and CO2 Unit |
| Prior XY stage | Prior | H107 | Motorized XY microscope stage |
| PrismR Centrifuge | Labnet | C2500-R | Temperature controlled microcentrifuge |
| Problot Hybridization oven | Labnet | H1200A | Rocking Incubator for infection with Chlamydia |
| Proscan II | Prior | H30V4 | XYZ microscope stage controler |
| Purifier Class 2 Biosafety Cabinet | Labconco | 362804 | Cell culture work |
| RPMI-1640 (no phenol red) | Gibco | 11835-030 | Base growth media for imaging |
| RPMI-1640 (phenol red) | GE Life Sciences | SH30027.01 | Base growth media |
| scopeLED excitation LEDs (470nm,595nm) | scopeLED | F140 | Excitation light |
| Sonic Dismembrator Model 500 | Fisher Scientific | 15-338-550 | Sonicator, resuspending chlamydial pellet |
| Stage incubator | OKO Labs | H301-K-FRAME | Cluster well plate incubation chamber |
| sucrose-phosphate-glutamate buffer 1X (SPG) | In house | NA | Chlamydial storage buffer. (10 mM sodium phosphate [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM sucrose, 0.50 mM L-glutamic acid; pH 7.4) |
| T-75 Flasks | Thermo Scientific | 156499 | Cell culture growth |
| TE 300 inverted microscope | Nikon | 16724 | microscope |
| THOR LED | Thor Labs | LEDD1B | White light |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | Dislodges host cells from flask for seeding into plates |
| Zyla sCMOS | Andor | ZYLA-5.5-USB3 | imaging camera |
| µManager 2.0gamma | https://github.com/micro-manager/micro-manager | NA | Open sourse automated microscope control software package |
Riferimenti
- AbdelRahman, Y., Belland, R. The chlamydial developmental cycle. FEMS Microbiology Reviews. 29 (5), 949-959 (2005).
- Clifton, D., et al. A chlamydial type III translocated protein is tyrosine-phosphorylated at the site of entry and associated with recruitment of actin. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 101 (27), 10166-10171 (2004).
- Yu, H. H. Y., Tan, M. σ28 RNA polymerase regulates hctB, a late developmental gene in Chlamydia. Molecular Microbiology. 50 (2), 577-584 (2003).
- Koo, I., Stephens, R. A Developmentally Regulated Two-component Signal Transduction System in Chlamydia. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17314-17319 (2003).
- Grieshaber, S., et al. Impact of Active Metabolism on Elementary Body Transcript Profile and Infectivity. Journal of Bacteriology. 200 (14), 00065 (2018).
- Belland, R., et al. Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 100 (14), 8478-8483 (2003).
- Wang, Y., et al. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258 (2011).
- Nguyen, B., Valdivia, R. Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (4), 1263-1268 (2012).
- Mueller, K., Wolf, K., Fields, K., Maurelli, A. Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. MBio. 7 (1), 01817 (2016).
- Rosario, C. J., Tan, M. The early gene product EUO is a transcriptional repressor that selectively regulates promoters of Chlamydia late genes. Mol Microbiol. 84 (6), 1097-1107 (2012).
- Brickman, T., Barry, C., Hackstadt, T. Molecular cloning and expression of hctB encoding a strain-variant chlamydial histone-like protein with DNA-binding activity. Journal of Bacteriology. 175 (14), 4274-4281 (1993).
- Omsland, A., Sager, J., Nair, V., Sturdevant, D., Hackstadt, T. Developmental stage-specific metabolic and transcriptional activity of Chlamydia trachomatis in an axenic medium. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (48), 19781-19785 (2012).
- Su, H., et al. A recombinant Chlamydia trachomatis major outer membrane protein binds to heparan sulfate receptors on epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 93 (20), 11143-11148 (1996).
- Edelstein, A., et al. Computer control of microscopes using µManager. Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Plotly Technologies Inc. . Collaborative data science. , (2015).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochemical Journal. 418 (3), 567-574 (2009).
- Sega, G. A review of the genetic effects of ethyl methanesulfonate. Mutation Research. 134 (2-3), 113-142 (1984).
- Ferguson, L., Denny, W. Frameshift mutagenesis by acridines and other reversibly binding DNA ligands. Mutagenesis. 5 (6), 529-540 (1990).
