Minimiser l’hypoxie dans les tranches hippocampales des souris adultes et vieillissantes
Summary
Il s’agit d’un protocole pour la préparation des tranches aiguës de l’adulte et le vieillissement hippocampi souris qui tire parti de la perfusion transcardique et la coupe de tranches avec la glace-froid NMDG-aCSF pour réduire les dommages hypoxiques au tissu. Les tranches qui en résultent restent en bonne santé pendant de nombreuses heures et conviennent aux corrections à long terme et aux enregistrements sur le terrain.
Abstract
Les tranches hippocampales aiguës ont permis à des générations de neuroscientifiques d’explorer en détail les propriétés synaptiques, neuronales et de circuits et avec une haute fidélité. L’exploration des mécanismes de LTP et de LTD, le calcul dendritique de neurone simple, et les changements d’expérience-dépendant dans les circuits, n’aurait pas été possible sans cette préparation classique. Cependant, à quelques exceptions près, la plupart des recherches fondamentales utilisant des tranches hippocampales aiguës ont été effectuées à l’aide de tranches de rongeurs d’âges relativement jeunes, ~P20-P40, même si les mécanismes synaptiques et intrinsèques d’excitabilité ont une longue queue de développement qui atteint le P60. L’attrait principal de l’utilisation de jeunes tranches hippocampales est la préservation de la santé neuronale facilitée par une plus grande tolérance aux dommages hypoxiques. Cependant, il est nécessaire de comprendre la fonction neuronale à des stades plus matures du développement, accentué par le développement de divers modèles animaux de maladies neurodégénératives qui nécessitent une préparation du cerveau vieillissant. Ici, nous décrivons une modification à une préparation aiguë de tranche hippocampal qui fournit de manière fiable des tranches saines de l’adulte et le vieillissement hippocampe souris. Les étapes critiques du protocole sont la perfusion transcardique et la coupe avec nmdg-aSCF sans sodium sans glace. Ensemble, ces étapes atténuent la baisse induite par l’hypoxie dans l’ATP lors de la décapitation, ainsi que l’œdème cytotoxique provoqué par les flux passifs de sodium. Nous montrons comment couper les tranches transversales de l’hippocampe plus le cortex à l’aide d’un microtome vibrant. Les tranches hippocampales aiguës obtenues de cette façon sont fiables et saines pendant de nombreuses heures d’enregistrement, et sont appropriées pour les enregistrements sur le terrain et les enregistrements ciblés de correction-clamp, y compris le ciblage des neurones fluorescents étiquetés.
Introduction
L’avènement des préparations aiguës de tranches cérébrales des mammifères a facilité des expériences au niveau cellulaire et synaptique qui n’étaient auparavant possibles que dans les préparations d’invertébrés comme l’Aplysia1. Le développement de tranches hippocampales aiguës était d’une importance particulière, car il s’agit d’une structure responsable de la mémoire de travail et de la formation de contexte, et dispose d’un circuit tri-synaptique spécialisé qui est susceptible de manipulation physiologique facile. Cependant, la grande majorité des tranches cérébrales aiguës sont encore préparées à partir de souris et de rats relativement jeunes, car il est plus facile de préserver les neurones et les circuits sains, et les tranches restent viables pendant de plus longues périodes de temps2,3,4. Ici, nous introduisons des modifications aux protocoles de tranchage standard qui se traduisent par une viabilité accrue des tranches hippocampales aiguës des souris adultes et vieillissantes.
Le principal obstacle à la viabilité ex vivo à long terme du parenchyme cérébral des mammifères est les dommages hypoxiques initiaux qui se produisent rapidement une fois que le flux sanguin vers le cerveau cesse après la décapitation. La perte d’oxygène entraîne une consommation métabolique rapide de ressources énergétiques importantes dans le cerveau avec la perte de phospho-créatine (P-créatine) étant la plus rapide, suivie par le glucose, l’adénosine triphosphate (ATP), et le glycogène4. La préservation de l’ATP est d’une importance particulière pour la santé à long terme des tranches de cerveau, comme ATP est nécessaire pour maintenir le potentiel de la membrane via le Na-K ATPase, et par conséquent l’activité neuronale5,6. Le niveau d’ATP dans le cerveau adulte de rongeur est ~2.5 mM, et il tombe précipitamment dans 20 s de décapitation pour atteindre un état stable basal (~0.5 mM) à environ 1 min post-décapitation4,7,8. Chez les jeunes animaux, il faut plus de temps pour observer la même baisse de l’ATP (~2 min); avec anesthésie phénobarbitale, il est encore ralenti à 4 min4. Ces considérations montrent que la prévention de la perte d’ATP et d’autres ressources énergétiques est une stratégie nécessaire pour prévenir les dommages hypoxiques au cerveau et à son tour pour maintenir la santé des tranches de cerveau sur de plus longues périodes de temps, en particulier chez les animaux adultes.
Les basses températures ralentissent le métabolisme. Par conséquent, il a été démontré que l’hypothermie modeste protège les réserves d’énergie du cerveau: chez les jeunes animaux, abaissant la température corporelle de six degrés, de 37 °C à 31 °C, préserve les niveaux d’ATP à environ 80% des niveaux normaux de plus de 4 h d’hypoxie contrôlée9. Les niveaux de p-créatine sont également préservés, ainsi que le potentiel global de phosphorylation9. Ceci suggère que l’abaissement de la température du corps avant la décapitation pourrait être neuroprotecteur, car des niveaux presque normaux d’ATP pourraient être maintenus par les périodes de découpage et de récupération de tranche.
Dans la mesure où une baisse d’ATP ne peut pas être complètement empêchée lors de la décapitation, on s’attend à une fonction partiellement altérée de l’ATPase Na-K, suivie d’une dépolarisation par l’afflux passif de sodium. Comme l’afflux passif de sodium est suivi par l’entrée de l’eau dans les cellules, il provoque l’œdème cytotoxique et éventuellement la pyknose. Chez les rats adultes, le remplacement des ions Na+ par du saccharose dans des solutions de coupe de tranches a été une stratégie réussie pour alléger le fardeau de l’œdème cytotoxique10,11. Plus récemment, les cations organiques méthylées qui diminuent la perméabilité des canaux de sodium12 ont montré qu’elles offrent une protection plus efficace que le saccharose, en particulier dans les tranches de souris adultes, le N-méthyl-D-glucamine (NMDG) étant le plus largement applicable à différents âges et régions du cerveau13,14,15,16.
De nombreux protocoles de coupe du cerveau impliquent l’utilisation de températures froides seulement pendant l’étape de coupe de tranches, parfois en combinaison avec la stratégie de remplacement de Na+ ion16,17. Chez les jeunes animaux, ces protocoles semblent offrir une neuroprotection suffisante puisque les cerveaux peuvent être extraits rapidement après la décapitation parce que le crâne est encore mince et facile à enlever3. Cependant, cette stratégie ne produit pas de tranches saines d’animaux adultes. Au fil du temps, un certain nombre de laboratoires d’étude des rongeurs adultes ont introduit la perfusion transcardique avec une solution glacée pour diminuer la température corporelle de l’animal, et donc des dommages hypoxiques au cerveau, avant la décapitation. Cette procédure a été appliquée avec succès pour produire des tranches de cérebelaire18, tranches de midbrain19, tranches néocorticales11,20, cortex périrhinal21, hippocampe rat10,22,23, ampoule olfactive24, striatum ventral25, cortex visuel26.
En dépit des avantages offerts par la perfusion transcardique et le remplacement de Na+ ion dans la préparation des tranches de rat et dans certaines régions du cerveau chez la souris, l’hippocampe souris reste l’un des domaines les plus difficiles à protéger de l’hypoxie13,20. À ce jour, l’une des approches les plus courantes pour trancher l’hippocampe à partir de souris vieillissantes et de modèles de souris de neurodégénérescence implique le tranchage rapide classique de l’hippocampe isolé27. Dans le protocole décrit ici, nous minimisons la perte d’ATP dans le cerveau adulte en introduisant l’hypothermie avant la décapitation par transcardially perfuser l’animal avecna+ glacé – fluide céphalo-rachidien artificiel à base de NMDG libre (NMDG-aCSF). Les tranches sont ensuite coupées en Na+-free NMDG-aCSF. Avec ce protocole amélioré, nous obtenons des tranches hippocampales aiguës de souris adultes et vieillissantes qui sont en bonne santé jusqu’à 10 h après le tranchage et sont appropriés pour les enregistrements de terrain à long terme et les études de patch-clamt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici démontre que les tranches hippocampales obtenues à partir de souris adultes et vieillissantes peuvent rester en bonne santé et viables pendant de nombreuses heures après la coupe. Les tranches préparées à l’aide de ce protocole sont appropriées pour les enregistrements de pinces à patch, ainsi que les enregistrements de terrain de longue durée dans les régions CA1.
Il y a deux étapes critiques dans ce protocole. La première étape est l’étape de perfu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Je remercie la Dre Carla J. Shatz pour ses conseils et leur soutien, ainsi que la Dre Barbara K. Brott et Michelle K. Drews d’avoir lu le manuscrit de façon critique. Les travaux sont soutenus par les NIH EY02858 et les subventions de la Fondation de bienfaisance Mathers à CJS.
Materials
| “60 degree” tool | made in-house | ||
| #10 scalpel blade | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371110 | |
| 1M CaCl2 | Fluka Analytical | 21114 | |
| 95%O2/5%CO2 | Praxiar or another local supplier | ||
| Acepromazine maleate (AceproJect) | Henry Schein | 5700850 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| Beakers, measuring cylinders, reagent bottles | |||
| Brushes size 00-2 | Ted Pella | Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella. | |
| CCD camera | Olympus | XM10 | |
| Choline bicarbonate | Pfalz & Bauer | C21240 | |
| Cyanoacrilate glue | Krazy glue | Singles | |
| Decapitation scissors | FST | 14130-17 | |
| Feather blades | Feather | FA-10 | |
| Filter paper #2 | Whatman | Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well. | |
| Forceps | A. Dumont & Fils | Inox 3c | |
| Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) – porosity 3 | Robuglas.com | 18103 or 18113 | Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | |
| Ice buckets | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Ketamine HCl (KetaVed) | VEDCO | NDC 50989-996-06 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Leica Tissue slicer VT1000S | The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2 | ||
| Magnetic stirrers and stir bars | |||
| Mg2SO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| MilliQ water machine | Millipore | Source for 18 Mohm water | |
| Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4035 | |
| Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | P8574 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | EMD | SX0320-1 | |
| Needle 27G1/2 | |||
| NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Paper tape | |||
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | #7553-70 | |
| Peristaltic pump head | Cole-Parmer | Masterflex #7518-00 | |
| Personna blades | Personna double edge | Amazon | |
| pH meter | |||
| Recovery chamber | in-house made | ||
| Scalpel blade handle size 3 | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371030 | |
| Scissors angled blade | FST | 14081-09 | |
| Single edge industrial razor blade #9 | VWR | 55411 | |
| Spatulas | |||
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 225 | |
| Upright microscope | Olympus BX51WI | ||
| Xylazine HCl (XylaMed) | VetOne | 510650 |
Riferimenti
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