Minimizar la hipoxia en las rebanadas de hipocampo de ratones adultos y envejecidos
Summary
Este es un protocolo para la preparación aguda de la rebanada de hipocampo adulto y envejecido del ratón que aprovecha la perfusión transcardial y el corte de rodajas con NMDG-aCSF helado para reducir el daño hipoxico al tejido. Las rebanadas resultantes se mantienen saludables durante muchas horas y son adecuadas para grabaciones de parches y de campo a largo plazo.
Abstract
Las rebanadas agudas del hipocampo han permitido a generaciones de neurocientíficos explorar las propiedades sinápticas, neuronales y de circuito en detalle y con alta fidelidad. La exploración de los mecanismos LTP y LTD, el cálculo dendrítico de una sola neurona y los cambios dependientes de la experiencia en los circuitos, no habrían sido posibles sin esta preparación clásica. Sin embargo, con algunas excepciones, la mayoría de las investigaciones básicas utilizando rodajas agudas de hipocampo se han realizado utilizando rebanadas de roedores de edades relativamente jóvenes, P20-P40, a pesar de que los mecanismos de excitabilidad sináptica e intrínseca tienen una larga cola de desarrollo que supera el P60. El principal atractivo del uso de rebanadas de hipocampo joven es la preservación de la salud neuronal ayudada por una mayor tolerancia al daño hipoxico. Sin embargo, hay una necesidad de entender la función neuronal en etapas más maduras de desarrollo, acentuado aún más por el desarrollo de varios modelos animales de enfermedades neurodegenerativas que requieren una preparación cerebral envejecida. Aquí describimos una modificación a una preparación aguda de la rebanada del hipocampo que entrega de forma fiable rebanadas saludables de hipocampos adultos y de ratón envejecido. Los pasos críticos del protocolo son la perfusión transcardial y el corte con NMDG-aSCF sin sodio helado. Juntos, estos pasos atenúan la caída inducida por hipoxia en ATP tras la decapitación, así como el edema citotóxico causado por los flujos pasivos de sodio. Demostramos cómo cortar rodajas transversales de hipocampo más corteza usando un microtoma vibratorio. Las rebanadas agudas del hipocampo obtenidas de esta manera son confiablemente saludables durante muchas horas de grabación, y son apropiadas tanto para grabaciones de campo como para grabaciones dirigidas de abrazaderas de parches, incluida la segmentación de neuronas con la etiqueta fluorescente.
Introduction
El advenimiento de las preparaciones agudas de la rebanada cerebral de los mamíferos facilitó experimentos a nivel celular y sináptico que antes sólo eran posibles en preparaciones de invertebrados como Aplysia1. El desarrollo de rebanadas agudas del hipocampo fue de particular importancia, ya que es una estructura responsable de la memoria de trabajo y la formación de contexto, y tiene un circuito trisináptico especializado que es amenable a la manipulación fisiológica fácil. Sin embargo, la gran mayoría de las rebanadas cerebrales agudas todavía se preparan a partir de ratones y ratas relativamente jóvenes, ya que es más fácil preservar las neuronas y circuitos sanos, y las rebanadas siguen siendo viables durante períodos más largos de tiempo2,,3,,4. Aquí, introducimos modificaciones en los protocolos de corte estándar que resultan en una mayor viabilidad de las rodajas agudas del hipocampo de ratones adultos y envejecidos.
El principal impedimento para la viabilidad ex vivo a largo plazo del parénquima cerebral de los mamíferos es el daño hipoxico inicial que ocurre rápidamente una vez que el flujo sanguíneo al cerebro deja de disminuir. La pérdida de oxígeno resulta en un consumo metabólico rápido de los principales recursos energéticos en el cerebro con la pérdida de fosfo-creatina (P-creatina) siendo el más rápido, seguido de glucosa, trifosfato de adenosina (ATP), y glucógeno4. La preservación de ATP es de particular importancia para la salud a largo plazo de las rebanadas cerebrales, ya que el ATP es necesario para mantener el potencial de membrana a través de la ATPase Na-K, y en consecuencia la actividad neuronal5,6. El nivel de ATP en el cerebro de los roedores adultos es de 2,5 mM, y cae precipitadamente dentro de 20 s de decapitación para alcanzar un estado estacionario basal (0,5 mM) en alrededor de 1 min después de la decapitación4,7,8. En animales jóvenes, se tarda más en observar la misma caída en ATP (2 min); con anestesia fenobarbital se ralentiza aún más a 4 min4. Estas consideraciones muestran que prevenir la pérdida de ATP y otros recursos energéticos es una estrategia necesaria para prevenir el daño hipoxico al cerebro y a su vez para mantener la salud de las rebanadas cerebrales durante períodos más largos de tiempo, especialmente en animales adultos.
Las bajas temperaturas ralentizan el metabolismo. Por lo tanto, se ha demostrado que la hipotermia modesta protege las reservas de energía cerebral: en animales jóvenes, reduciendo la temperatura corporal en seis grados, de 37 oC a 31 oC, preserva los niveles de ATP a alrededor del 80% de los niveles normales durante 4 h de hipoxia controlada9. Los niveles de P-creatina se conservan de manera similar, así como el potencial general de fosforilación9. Esto sugiere que bajar la temperatura corporal antes de la decapitación podría ser neuroprotector, como niveles casi normales de ATP podrían mantenerse a través de los períodos de corte por rebanada y recuperación de la rebanada.
En la medida en que una caída de ATP no se puede prevenir completamente tras la decapitación, se espera una función parcialmente deteriorada de la ATPase Na-K, seguida de la despolarización a través de la afluencia pasiva de sodio. Como la afluencia pasiva de sodio es seguida por la entrada de agua en las células, causa edema citotóxico y eventualmente piknosis. En ratas adultas, la sustitución de iones Na+ por sacarosa en soluciones de corte por rodajas ha sido una estrategia exitosa para aliviar la carga del edema citotóxico10,11. Más recientemente, los cationes orgánicos metilados que disminuyen la permeabilidad del canal de sodio12 han demostrado ofrecer una protección más eficaz que la sacarosa, especialmente en rodajas de ratones adultos, siendo N-metil-D-glucamina (NMDG) más ampliamente aplicable en diferentes edades y regiones cerebrales13,,14,,15,,16.
Numerosos protocolos de corte cerebral implican el uso de temperaturas frías sólo durante el paso de corte por rebanadas, a veces en combinación con La estrategia de reemplazo de Na+ ion16,17. En animales jóvenes, estos protocolos parecen ofrecer suficiente neuroprotección ya que los cerebros se pueden extraer rápidamente después de la decapitación porque el cráneo es todavía delgado y fácil de eliminar3. Sin embargo, esta estrategia no produce rebanadas saludables de animales adultos. Con el tiempo, varios laboratorios que estudian roedores adultos han introducido la perfusión transcardial con una solución helada para disminuir la temperatura corporal del animal, y por lo tanto daño hipoxico al cerebro, antes de la decapitación. Este procedimiento se aplicó con éxito para producir rodajas cerebelosas18, rodajas de cerebro medio19, rodajas neocorticales11,20, corteza perirhinal21, hipocampo de rata10,22,23, bulbo olfativo24, estriado ventral25, corteza visual26.
A pesar de las ventajas que ofrece la perfusión transcardial y el reemplazo de iones Na+ en la preparación de rodajas de rata y en algunas regiones cerebrales en ratones, el hipocampo de ratón sigue siendo una de las zonas más desafiantes para protegerse de la hipoxia13,,20. Hasta la fecha, uno de los enfoques más comunes para cortar el hipocampo de ratones envejecidos y modelos de ratón de neurodegeneración implica el corte rápido clásico del hipocampo aislado27. En el protocolo descrito aquí, minimizamos la pérdida de ATP en el cerebro adulto mediante la introducción de hipotermia antes de la decapitación perfundiendo transcardimente al animal con el frío helado Na+– fluido cefalorraquídeo artificial basado en NMDG libre (NMDG-aCSF). Las rebanadas se cortan en Na+libre de hielo NMDG-aCSF. Con este protocolo mejorado obtenemos rebanadas agudas de hipocampo de ratones adultos y envejecidos que son saludables hasta 10 h después del corte y son apropiados para grabaciones de campo a largo plazo y estudios de parches.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí demuestra que las rebanadas de hipocampo obtenidas de ratones adultos y envejecidos pueden permanecer saludables y viables durante muchas horas después del corte. Los sectores preparados con este protocolo son adecuados para grabaciones de abrazaderas de parches, así como grabaciones de campo de larga duración en las regiones CA1.
Hay dos pasos críticos en este protocolo. El primer paso es el paso de perfusión transcardial con una solución helada. El aclaramie…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradezco a la Dra. Carla J. Shatz por consejo y apoyo, y a la Dra. Barbara K. Brott y Michelle K. Drews por leer críticamente el manuscrito. El trabajo es apoyado por NIH EY02858 y la Fundación Mathers Charitable otorga a CJS.
Materials
| “60 degree” tool | made in-house | ||
| #10 scalpel blade | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371110 | |
| 1M CaCl2 | Fluka Analytical | 21114 | |
| 95%O2/5%CO2 | Praxiar or another local supplier | ||
| Acepromazine maleate (AceproJect) | Henry Schein | 5700850 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| Beakers, measuring cylinders, reagent bottles | |||
| Brushes size 00-2 | Ted Pella | Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella. | |
| CCD camera | Olympus | XM10 | |
| Choline bicarbonate | Pfalz & Bauer | C21240 | |
| Cyanoacrilate glue | Krazy glue | Singles | |
| Decapitation scissors | FST | 14130-17 | |
| Feather blades | Feather | FA-10 | |
| Filter paper #2 | Whatman | Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well. | |
| Forceps | A. Dumont & Fils | Inox 3c | |
| Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) – porosity 3 | Robuglas.com | 18103 or 18113 | Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | |
| Ice buckets | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Ketamine HCl (KetaVed) | VEDCO | NDC 50989-996-06 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Leica Tissue slicer VT1000S | The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2 | ||
| Magnetic stirrers and stir bars | |||
| Mg2SO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| MilliQ water machine | Millipore | Source for 18 Mohm water | |
| Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4035 | |
| Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | P8574 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | EMD | SX0320-1 | |
| Needle 27G1/2 | |||
| NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Paper tape | |||
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | #7553-70 | |
| Peristaltic pump head | Cole-Parmer | Masterflex #7518-00 | |
| Personna blades | Personna double edge | Amazon | |
| pH meter | |||
| Recovery chamber | in-house made | ||
| Scalpel blade handle size 3 | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371030 | |
| Scissors angled blade | FST | 14081-09 | |
| Single edge industrial razor blade #9 | VWR | 55411 | |
| Spatulas | |||
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 225 | |
| Upright microscope | Olympus BX51WI | ||
| Xylazine HCl (XylaMed) | VetOne | 510650 |
Riferimenti
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