Summary
一方的な尿管閉塞(UUO)を有するマウスの腎臓におけるマイクロRNA発現を定量的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により評価する方法を説明する。このプロトコルは、UUOを有するマウスおよび他の病理学的状態の文脈における腎臓マイクロRNA発現プロファイルの研究に適している。
Abstract
マイクロRNA(miRNA)は、一本鎖で非コード化されたRNA分子であり、メッセンジャーRNA(mRNA)の3'非翻訳領域(UTR)の部分的に相補的な標的部位に結合することによって転写後レベルで遺伝子発現を調節するのが一般的であり、mRNAの翻訳および安定性を低下させる。マウスの様々な臓器や組織におけるmiRNA発現プロファイルは検討されているが、マウス腎臓におけるmiRNAの精製および定量のための標準的な方法は利用できなかった。我々は、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)による腎間質線維化によるマウス腎におけるmiRNA発現を抽出し、評価するための効果的かつ信頼できる方法を確立した。このプロトコルには、(1)シャムと一方的な尿管閉塞(UUO)マウスの作成の5つのステップが必要でした。(2) UUOマウスからの腎臓サンプルの抽出;(3) 腎臓サンプルからのmiRNAを含む全RNAの抽出;(4) 相補的 DNA (cDNA) miRNA からの逆転写による合成;(5) cDNAを用いたqRT-PCRを用いた。このプロトコルを用いて、対照と比較してmiRNA-3070-3pの発現が有意に増加し、miRNA-7218-5pおよびmiRNA-7219-5pの発現が腎間質線維症のマウスモデルの腎臓において有意に減少したことを確認した。このプロトコルは、UUOを有するマウスの腎臓におけるmiRNA発現を決定するために使用することができる。
Introduction
マイクロRNA(miRNA)は、メッセンジャーRNA(mRNA)1の分解および転写阻害を引き起こす短い非コードRNAであり、生理学1と疾患(例えば、炎症、線維症、代謝障害、癌)の両方において重要な役割を果たしている様々なmRNAの発現を調節することが示されている。したがって、miRNAの一部は,、様々な疾患2、3、4、53の新しい2バイオマーカーおよび治療標的の候補である可能性がある。,45脳、心臓、肺、肝臓、腎臓を含むマウスの臓器および組織におけるmiRNA発現プロファイルは66、7、8、9、107,8,9,10と記載されているが、腎間質線維症を有するマウス腎臓におけるmiRNAの抽出および評価のための標準的な方法は存在しなかった。
腎間質線維症を有するマウスの腎臓におけるmiRNAの表現を確実に精製し、検出するプロトコルを設計した。このプロトコルには、次の 5 つの主要な手順が含まれます。(1) 8週齢のC57BL/6雄マウスは、恥ずかし操作(コントロール)を受けるマウスと、腎間質線維症に結合する一方的な尿管閉塞(UUO)を提供する手術を受けるマウスのグループに分けられる。(2)腎臓試料は、シャムマウスとUUOマウスから抽出され、ケイ素ホモジナイザーで別々にホモジナイズされ、次いでマイクロ遠心分離機スピンカラム11,12,12上の生体高分子シュレッディングシステムに移される。(3)miRNAを含む全RNAは、シリカ膜ベースのスピンカラム12、13,13によって腎臓サンプルから抽出される。(4)この抽出された全RNAを用いて、逆転写酵素、ポリ(A)ポリメラーゼ、及びオリゴdTプライマー14,15,15を用いて全RNAから相補的DNA(cDNA)を合成する。(5)miRNAの式は、インターカレート色素14,15,15を用いて定量的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)により評価される。
このプロトコル,は、様々な組織11、12、13、14、15の様々な組織11,12,13,14でmiRNAの有意義な抽出と評価を得た調査に基づいており、プロトコルで使用される生体高分子細断システムは、200612年に組織から高品質の総RNAを精製することが示された。15さらに、以前の研究では、インターカレートダイ14,15を用いてqRT-PCRによるmiRNA発現の測定に用いるプロトコルの側面(すなわち、逆転写酵素によるcDNA合成、ポリ(A)ポリメラーゼ、および抽出された全RNAからのオリゴ-dTプライマー)の正確性と15感度を確認した。新しいプロトコルは、簡便さ、時間節約、および技術的なエラーの削減の利点を有するため、このプロトコルは、マウス腎臓におけるmiRNAプロファイルの正確かつ敏感な同定を必要とする研究に使用することができる。さらに、このプロトコルは、多くの病理学的状態の調査に適用することができる。
次に、腎間質線維症に関連するUUOを有するマウスにおけるmiRNA発現プロファイルの決定について説明する。ヒトにおいて、腎間質線維症は、病因16,17,17に関係なく慢性腎疾患および末期腎疾患の両方の共通かつ重要な特徴である。この腎間質線維症は、腎不全の進行に関連しており、そして間質空間における細胞外マトリックス成分(例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、およびα平滑筋アクチン)17,18,18の表現の増加によって特徴付けられる。
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Protocol
すべての動物実験プロトコルは、吉地医科大学動物倫理委員会によって承認され、実験動物のための吉地医科大学ガイドから実験動物の使用とケアのガイドラインに従って行われました。
1. 恥の手術
- イゾフルラン、コルクシート、脱毛剤クリーム、実験室用ワイプ、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)付きのペトリ皿、4-0ナイロン、ピンセット、外科用ハサミ、綿棒、8週齢のC57BL/6オスマウスを用意します。
- 1.5%のイオブルランでマウスを麻酔し、1.5%に維持します。次に、脱毛クリームをマウスの腹部に塗布します。数分後、脱毛クリームをPBS浸した実験室の拭き取りで拭き取ります。
- マウスの腹部に70%エタノールを注入し、その後、スピーフィンの位置にコルクシートの上にマウスを置きます。
- 手術用ハサミとピンセットを使用して、腹部の皮膚に切開を行い、膀胱から肋骨の左端に筋肉と腹膜を切断します。
- PBSで綿棒を2本湿らせ、腸を慎重に横に引っ張ります。湿らせた綿棒を置いて、左腎臓と尿管を識別します。
- 腹膜を閉じ、4-0ナイロンで切開を閉じます。
2. UUO手術
- イゾフルラン、コルクシート、脱毛剤クリーム、実験室のワイプ、PBS付きペトリ皿、4-0シルク、4-0ナイロン、2.5 mLシリンジ、綿綿棒、ピンセット、外科用ハサミ、および8週齢のC57BL/ 6マウスの男性。
- 1.5%のイオブルランでマウスを麻酔し、1.5%に維持します。次に、脱毛クリームをマウスの腹部に塗布します。数分後、脱毛クリームをPBS浸した実験室の拭き取りで拭き取ります。
- マウスの腹部マウスに70%エタノールを注入し、コルクシートの上の上の上の上のsupineの位置にマウスを置きます。
- 手術用ハサミとピンセットを使用して、腹部の皮膚に切開を行い、膀胱から肋骨の左端に筋肉と腹膜を切断します。
- マウスの下に2.5 mLの注射器を置きます。綿棒を2本取り、PBSで湿らせる。腸をピンセットで慎重に横に引っ張り、湿らせた綿棒を適切に置いて左尿管を識別する。ピンセットを使用して、左腎臓を持ち上げます。
- 4-0シルクを使用して、約1cm離れた2箇所で左尿管をリゲートします。2つの結紮の中心点で尿管を切り、4-0ナイロン縫合糸を使用して腹膜と切開部を閉じます。
3. 腎臓サンプルの収集
- 準備:1.5 mLマイクロ遠心チューブ、イゾフルラン、コルクシート、70%エタノール、PBS付きペトリ皿、ピンセット、および外科用ハサミ。
- 1.5%のイオブルランでマウスを麻酔し、1.5%に維持します。その腹部に70%エタノールを注入し、supine位置のコルクシートの上にマウスを置きます。
- 手術用ハサミとピンセットを使用して、腹部の皮膚に切開を行い、膀胱から肋骨の左端に筋肉と腹膜を切断します。
- ピンセットで腹膜を持ち上げます。手術用はさみで、腹膜の上端に横切開を行い、肋骨の最下端に沿って切開を続ける。
- 次に、左腎臓を特定し、腎臓が黄色白くなるまでPBSで還流して血管から血液を洗い流し、手術用ハサミで左腎動脈と静脈を切断して腎臓を取り除く。ペトリ皿に腎臓を入れ、PBSで慎重に洗います。
- 手術用はさみとピンセットで10mgのサンプルに腎臓をカットします(10mgは次のステップに適したサイズです)。腎臓の各部分を独自の1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに入れ、チューブのキャップを閉じます。
- マイクロ遠心分離チューブを液体窒素に移し、使用前に長期保存のためにチューブを−80°Cに保ちます。
腎臓サンプルからの全RNAの抽出
- 以下の項目を準備する:1.5 mLマイクロ遠心分離管、2.0 mLマイクロ遠心分離管、100%エタノール、 クロロホルム、ケイ素ホモジナイザー、氷、ボルテックスミキサー、2.0 mLコレクションチューブ11、12、,12膜固定スピンカラムの2.0 mLコレクションチューブ12、13、13フェノール/グアニジンベースのライシス試薬、グアニジンおよびエタノールを含む洗浄緩衝液(洗浄バッファー1)、エタノール(洗浄バッファー1)、およびエタノールを含む洗浄緩衝液(洗浄バッファー1)、およびエタノールを含む洗浄緩衝液(洗浄バッファー1)、および2.0 mLコレクションチューブ内のスピンカラム12
- シリコンホモジナイザーに10mgの腎臓サンプルを入れます。ホモジナイザーにフェノール/グアニジンベースのリシス試薬を700μL加えます。
- ホモジナイザーを準備し、ホモジナイザーの害虫を腎臓サンプルに対してゆっくりと押し/ねじり、サンプルを均質化します。腎臓サンプルがフェノール/グアニジンベースの溶解試薬に完全に溶解するまで、押し/ねじりを繰り返します。
- さらに試料を均質化するには、均質化したライセート(2.0 mL採取チューブ)を生体高分子スピンカラムに移します。
- 均質化したライセートを室温(RT)で3分間14,000 x g で回転させ、沈殿したライセートを未使用の1.5 mLマイクロ遠心分離管に移します。
- チューブ内のライセートをクロロホルム140μLと組み合わせ、チューブキャップをしっかりと閉じます。ライセートとクロロホルムを混合するには、チューブを15回反転する。
注意:クロロホルムはフードなしで使用することができます。 - RTで2〜3分間各サンプルをインキュベートし、各サンプルを12,000 x g で4°Cで15分間回転させます。
- 沈殿物を乱さずに、上澄み(通常は約300 μL)を新しい1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに移し、その体積(通常は約450μL)の100%エタノールを加えます。混合物を5sの渦にする。
- サンプル700μLを2.0 mLのコレクションチューブの膜固定スピンカラムに積み込みます。列のキャップを閉じ、15 s の場合は 15,000 x g で 列を回転させます。集塵したライセートを回収管に捨てる。
- 2.0 mLのコレクションチューブの膜固定スピンカラムに700 μLの洗浄バッファー1を加えてサンプルを十分に洗浄します。列のキャップを閉じ、15 s の場合は 15,000 x g で 列を回転させます。集塵したライセートを回収管に捨てる。
- 洗浄バッファー 2 の 500 μL を 2.0 mL のコレクションチューブの膜固定スピンカラムに積み込み、微量塩を除去します。列のキャップを閉じ、15 s の場合は 15,000 x g で 列を回転させます。集塵したライセートを回収管に捨てる。
注:膜固定スピンカラムは、RNAとDNAを分離することができます。 - ステップ 4.11 をもう一度実行します。
- 2.0 mLコレクションチューブ内の膜固定スピンカラムを15,000 x g で再び1分間回転させます。集塵したライセートを回収管に捨てる。
- 膜固定スピンカラムを新しい1.5 mLコレクションチューブに移します。カラムに30μLのRNaseフリー水を加えて、総RNAを溶解します。カラムキャップを閉じ、室温で5分待ちます。次に、15,000 x g で 1 分間回転させます。
- 全RNAを含むサンプルの総量を新しいマイクロ遠心チューブに移します。各チューブを氷の上に置き、分光光度法により全RNAの濃度を測定する。
- 使用前に長期保管のために-80 °Cのサンプルとチューブを保ちます。
5. RNA全体の逆転写を用いるcDNAの合成
注: MIQE(定量的リアルタイムPCR実験の公表のための最低限の情報)ガイドラインは、より良い実験実践を奨励し、信頼性が高く明確な結果を得るのを助けるために発行されました19.このプロトコルでは、cDNAは、逆転写酵素、ポリ(A)ポリメラーゼ、オリゴdTプライマーを用いた2段階の手順で、精製された全RNAの1.0 μgから合成される。
- 1.5 mLマイクロ遠心チューブ、キャップ付き8ウェルストリップチューブ、各8ストリップチューブのキャップ、蒸留水、氷、逆転写キット(材料表参照)14、15,15溶融状態、サーマルサイクラー、およびボルテックスミキサーを準備します。
- サーマルサイクラーを起動します。
- マスターミックス溶液を準備する:2.0 μLの逆転写酵素ミックス(キットに含まれる)と10x核酸ミックスの2.0 μLを5xハイスペックバッファの4.0 μLに加えます(チューブあたり合計8.0 μLマスターミックスを得る)。
- 8ウェルストリップチューブの各チューブにマスターミックス溶液の8.0 μLを入れます。
- RNAの総密度を調整します。12μLのRNaseフリー水中の腎臓サンプルから1.0μgのRNAを分離するには、ステップ4.15で示した濃度データを使用して、適切な量の総RNAを蒸留水に移します。
注: DNAの汚染が存在する場合、汚染されたDNAはqRT-PCRで共同増幅されます。 - 各チューブに12μLのRNAのアリコートを入れ、チューブのキャップを閉じます。チューブを15×の遠心分離機。
- チューブをサーマルサイクラーに入れ、サンプルを37°Cで60分間インキュベートします。 次に、cDNAの合成のために、95°Cで5分間サンプルをすぐにインキュベートします。
- インキュベーションが完了したら、cDNAを新しい1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに移し、cDNAを蒸留水で10回(1:10)希釈します。5sのためのチューブをボルテックスと遠心分離機。
- 希釈したcDNAを氷の上に一時的に保存し、使用前に長期保存のためにサンプルを−80°Cに移動してください。
6. miRNAのqRT-PCR
注: インターカレーター法を用いてmiRNAのqRT-PCRを行いました。RNA用プライマーは、U6小核2(RNU6-2)、miRNA-3070-3p、miRNA-6401、miRNA-7218-5p、およびmiRNA-7219-5pが使用された。
- 以下の準備:1.5 mLマイクロ遠心分離管、 ボルテックスミキサー、qRT-PCR用96ウェル反応プレート、96ウェル反応プレート用粘着フィルム、接着フィルムアプリケーター、96ウェル遠心回転子、miRNA特異的プライマー、リアルタイムPCR機器、グリーン染料ベースPCRキット(材料表参照)14、15,15
- 1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに混合した後、以下の項目をボルテックス:蒸留水6.25μL、ヌクレアーゼフリー水に溶解した各5μM miRNAプライマーの1.25μL、2×PCRマスターミックスの12.5 μL、および2.5μLの10xユニバーサルプライマー。
- ステップ5で説明したように合成したcDNAを調製し、それを溶融する。5 sの場合にcDNAをボルテックスおよび遠心分離機にする。
- 96ウェルプレートの各ウェルに、試薬(ステップ6.2で説明したように作成)の22.5 μLアリコートを入れます。
- プレートの各ウェルにcDNAの2.5 μLアリコートを入れます。
- 粘着フィルムアプリケータを使用して、96ウェルプレートに密着フィルムを固定します。96ウェル遠心回転子を1,000 x g でプレートを遠心し、各ウェルの底部で反応を落ち着かせる。
7. PCR サイクリング
- リアルタイム PCR システムを起動し、ステップ 6.6 で説明したように作成したプレートを配置します。リアルタイム PCR システムで使用できます。次に実験プロパティを設定します。実験名を識別します。システムの実験タイプとして「96ウェル(0.2mL)」、定量方法として「比較CT(ΔΔCT)」、標的配列を検出する試薬として「SYBRグリーン試薬」、システムの実行として「標準」を選択します。
- サンプルと標的miRNAに名前を割り当て、各ウェル内のサンプルとターゲットmiRNAに名前を割り当てます。結果を確認するための適切なデータを取得するために、サンプルを重複して割り当てる必要があります。参照サンプルと内在性コントロールを選択し、受動参照として使用する色素に対して「なし」を選択します。試薬の交差汚染を排除するために、miRNA発現に対して負の逆転写酵素および非テンプレート制御を設定してください。
- 反応量設定が「20 μL」で、PCRサイクリング条件が95°Cで15分間、続いて94°Cで15秒で40サイクル、30秒で55°Cでアニーリング、30秒で70°Cで延長します。
- qRT-PCR プロセスが完了したら、システムのソフトウェアプログラムを使用して qRT-PCR データを分析します。ソフトウェア・プログラムによって自動的に選択されるしきい値行が各ウェルに適していることを確認します。
- 各サンプルで分析した内因性制御および標的miRNAの閾値サイクル(CT)を確認します。CT値は、増幅曲線と閾値線の交点によって決定される。本研究では、標的miRNA発現レベルの内在制御としてRNU6-2を用い、ΔΔCT法を用いて各標的miRNA20の相対的発現量を決定した。
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Representative Results
UUOマウスモデルは、20〜25gの体重を量る8週齢の雄マウスの21を記述した左尿管結紮によって作成された。4-0シルク縫合糸による二重結紮により、尿管は完全に妨害された。鎮痛薬(メロキシカム5mg/kg、皮下注射)は手術前および手術後2日間毎日投与された。手術後8日間で、腎臓を採取し、PBSですすいだ、解剖し、さらに分析するために液体窒素に貯蔵した。シャム作動したマウスはコントロールとして機能した。二重結紮は、左腎臓に水腎症がある場合に成功する。このUUOモデルを用いて得られたmiRNA qRT-PCRデータに基づいて、miRNA-3070-3pのレベルが有意に増加し、miRNA-7218-5pおよびmiRNA-7219-5pのレベルは、コントロールと比較してUUOマウスの腎臓において有意に減少した(図1)。
図1:UUOマウスの腎臓でミRNAを差し出して発現した。ミRNA-3070-3p、miRNA-6401、miRNA-7218-5p、およびmiRNA-7219-5p発現のmRT-PCR分析(n=8)およびUUOマウス(n=8)。値は標準誤差 (誤差範囲) ±平均値です。T検定は、グループ間の有意な違いを調査するために使用されました。p 値 <0.05 の T 検定は重要であると考えられました。miRNA:マイクロRNA、n.s:有意ではない、qRT-PCR:定量リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、UUO:一方的な尿管閉塞。*p<0.05。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
qRT-PCR を用いた上記のプロトコルは、標的 miRNA の発現レベルを正常に決定しました。抽出されたmiRNAの評価は、意味のあるqRT-PCRデータを得るために重要であり、そしてqRT-PCRを行う前にmiRNAの品質を確認するために、260nmでの吸光度の比率を280nmで分光光度計で確認する必要があります。qRT-PCRでは、予想される長さおよび融点または単一性融解曲線の単一PCR増幅が得られない場合、反応板の各ウェルにDNA汚染またはプライマーダイマーが存在する可能性があります。
miRNAの発現レベルは、マイクロアレイ、ノーザンブロッティング、リボヌクレアーゼ保護アッセイ法を含む、qRT-PCR以外のいくつかの方法で評価することができます。しかしながら、qRT-PCRは、正確かつ感度の高い、簡単で再現性の高い手順であり、より小さなサンプル量は、ノーザンブロッティングおよびリボヌクレアーゼ保護アッセイ22と比較してqRT-PCRに使用することができる。さらに、マイクロアレイは数万個のmiRNAの発現を同時に測定できるため、候補miRNAマーカーを同定することができます。マイクロアレイデータはqRT-PCR23で得られたデータと全体的に23高い相関を示しているが、異なる研究で得られたマイクロアレイデータを比較するための最適な方法論に関するコンセンサスは24に達していない。
新しいプロトコルには、次の制限があります。このプロトコルの有用性は、肝臓や肺などの他の器官では検証されていません。プロトコルは、他の実験動物(例えば、ラット、イヌ、ブタ)でテストされていません。いくつかのグループは、このプロトコル(qRT-PCRによるmiRNAの精製および検出のために)が組織,12、14、15,14からの高品質RNAの精製を可能にしたと報告した。15この方法は、miRNA発現12,14,を検出するための高精度かつ感度を有する。本報告書は、このプロトコルを使用してマウス腎臓におけるmiRNA発現を正常に検出できることを示している。このプロトコルは、このように疾患状態の広い範囲を有するマウスの腎臓におけるmiRNA発現プロファイルを決定するために使用することができる。プロトコルのシンプルさのために、多くのサンプルを同時に処理することができ、プロトコルを使用すると、腎臓の様々な病理学的状態で多くのmiRNAの発現の分析に貢献することができます。
プロトコルには、注意して留意する必要がある特定の側面があります。まず、精製されたRNAは、室温での劣化を防ぐために氷の上に保管する必要があります。腎臓サンプルは、溶解試薬でサンプルが完全に溶融するまで均質化する必要があります。マウス腎臓には溶解試薬に溶解しない実質的な結合組織が含まれているため、さらなる均質化にはカラムシュレッダーが必要です。第二に、このプロトコルの下で様々な物質の侵入が内因性制御miRNAの発現レベルを変化させ、結果を損なう可能性があるため、適切な内在性対照miRNA(その発現はサンプル間で安定している)を検証する必要があります。
結論として、マウス腎臓におけるマイクロRNA表現の検出、精製、評価のためのqRT-PCRプロトコルの詳細をUUOで発表しました。
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Disclosures
著者らは、利益相反はないと宣言している。
Acknowledgments
エダンツ・グループ(https://en-author-services.edanzgroup.com/)のミシェル・グッディ博士は、この原稿の草稿を編集してくれたことに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 | |
| Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 | |
| Tokyo Laboratory Animals Science | Not assigned | ||
| Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate | |
| Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate | |
| Qiagen | MS00001701 | 5'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00065141 | 5'-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3' | |
| Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3' | |
| Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit | |
| Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit | |
| Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software | |
| Qiagen | 129112 | ||
| Qiagen | MS00033740 | Not disclosed | |
| Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer | |
| ASKUL | GA04SW | ||
| AS ONE | ER1004NA45-KF2,62 -9968-32 |
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