RNA Blot Analisi per il rilevamento e la quantificazione dei microRNA vegetali

Summary

Questo metodo dimostra l'uso della tecnica di ibridazione settentrionale per rilevare i miRNA dall'estratto totale di RNA.

Abstract

I microRNA (miRNA) sono una classe di RNA non codificanti endogenamente espressi, da 21 nt piccoli RNA coinvolti nella regolazione dell'espressione genica sia nelle piante che negli animali. La maggior parte dei miRNA agisce come interruttori negativi dell'espressione genica mirata ai geni chiave. Nelle piante, le trascrizioni primarie di miRNA (pri-miRNA) sono generate dalla polimerasi RNA II e formano lunghezze variabili di strutture stabili ciclo-stelo chiamate pre-miRNA. Un endonuclease, simile a Dicer1, elabora i pre-miRNA in duplex miRNA-miRNA. Uno dei filamenti del duplex miRNA-miRNA è selezionato e caricato sulla proteina Argonaute 1 o sui suoi omologhi per mediare la scissione degli mRNA bersaglio. Sebbene i miRNA siano molecole chiave di segnalazione, il loro rilevamento viene spesso effettuato con metodi non ottimali basati sulla PCR anziché con un'analisi sensibile delle macchie settentrionali. Descriviamo un metodo settentrionale semplice, affidabile ed estremamente sensibile che è ideale per la quantificazione dei livelli di miRNA con una sensibilità molto elevata, letteralmente da qualsiasi tessuto vegetale. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per confermare la dimensione, la stabilità e l'abbondanza di miRNA e dei loro precursori.

Introduction

La recente scoperta di piccoli RNA regolatori, i microRNA, ha guidato la ricerca nella loro comprensione e del loro ruolo nelle piante e negli animali¹. I precursori lunghi dei miRNA vengono elaborati in miRNA maturi da 21 a 24 nt da HYL1 e specifiche proteine simili a^dicer2,,3. Un miRNA da 22 nt può avviare il silenziamento a cascata generando siRNA secondari⁴. Gli studi hanno dimostrato il ruolo dei miRNA e dei siRNA secondari nello sviluppo, nel destino cellulare e nelle risposte allo stress^5,6.

Protocol

1. Preparazione di un gel di poliacrilammide denatura 15%

1. Pesare e aggiungere 4,8 g di urea, aggiungere 3,75 mL del 40% di acrilammide: soluzione bisacrilamide (19:1) e 1 mL di 10x TBE pH 8.2 in un tubo sterile da 50 mL.
2. Sciogliere l'urea con un bagno d'acqua impostato a 60 gradi centigradi in una soluzione chiara.
3. Make-up il volume a 10 mL utilizzando acqua sterile appena autoclaved e raffreddare il mix di gel a temperatura ambiente.
4. Preparare una soluzione fresca per solifati di ammonio al 10%.

2. Assemblaggio delle lastre di vetro e dell'unità di elettroforesi

1. Lavare tutto l'apparat....

Results

In questa dimostrazione, abbiamo rilevato e quantificato l'espressione di miR397 in diversi tessuti di indica var whiteponni (Figura 1). miR397 è un miRNA da 22 nt e miRNA conservato. L'espressione di miR397 può essere rilevata in tutti i campioni testati. Secondo i dati di sequenziamento di nuova generazione, il campione 1 (tessuto di semina) ha miR397 a 5 letture per milione (rpm). Abbiamo rilevato il suo segnale comodamente, indicando che il metodo è molto sensibile e pu.......

Discussion

Questo metodo può essere ampiamente utilizzato per il rilevamento e la quantificazione di piccoli RNA, compresi i miRNA meno abbondanti. Il protocollo descrive principalmente i passaggi per decolorare l'RNA totale in un buffer di carico, la separazione delle dimensioni mediante elettroforesi gel, il trasferimento di RNA in una membrana, il collegamento incrociato dell'RNA sulla membrana e l'ibridazione utilizzando sonde oligo radioetichettate desiderate.

Il passo critico per qualsiasi esperime.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Soluzione di acrilammide-bisacrilammide al 40%	Sigma	A9926
Persolfato di ammonio (APS)	BioRad	1610700
Carta assorbente carta assorbente	whatmann I	1001-125
Blu di bromofenolo	Sigma	B5525-5G
Punte di caricamento capillare	BioRad	2239915
Deionizzato formamide	Ambion	AM9342
Blocco riscaldante	Eppendorff	5350
Hybond N+nylon	membrana GE	RPN203B
Bottiglia di ibridazione	Sigma	Z374792-1EA
Forno di ibridazione	Thermo Scientific	1211V79
N,N,N',N'-Tetrametiletilendiammina (TEMED)	Sigma	T7024-25ml
PhosphorImager	GE- Scanner per tifoni	29187194
Schermo e cassetta PhosphorImager	GE healthcare	GE28-9564-75
Pipette	Gilson, modelli: P20 e P10	FA10002M, FA10003M
Pipetta in plastica	Falcon	357550
Apparecchio in gel di poliacrilammide	BioRad	1658003EDU
Sephadex G-25 colonna	GE healthcare	27532501
Speed Vac concentratore	Thermo Scientific	20-548-130
Spinwin	Tarsons	1010
T4 Polinucleotide chinasi (PNK)	NEB	M0201S
Apparecchio Transblot	BioRad	1703946
ULTRAHyb tampone di ibridazione	Ambion	AM8670
Urea	Fischer Scientific	15985
UV-crosslinker	UVP	CL-1000L
Vortex	Tarsons	3020
Bagno d'acqua	NEOLAB	D-8810
Xilene cianolo	Sigma	X4126-10G