Her gir vi en protokoll for å generere in vitro NMJs fra humane induserte pluripotente stamceller (iPSCer). Denne metoden kan indusere NMJs med moden morfologi og funksjon i 1 måned i en enkelt brønn. De resulterende NMJs kan potensielt brukes til å modellere relaterte sykdommer, for å studere patologiske mekanismer eller å screene narkotikaforbindelser for terapi.
Det nevromuskulære krysset (NMJ) er en spesialisert synapse som overfører virkningspotensialer fra motorneuronet til skjelettmuskulatur for mekanisk bevegelse. Arkitekturen til NMJ-strukturen påvirker funksjonene til nevronen, muskelen og gjensidig interaksjon. Tidligere studier har rapportert mange strategier ved å co-culturing motor nevroner og myotubes å generere NMJ in vitro med komplekse induksjonsprosessen og lang kulturperiode, men har slitt med å rekafulere modne NMJ morfologi og funksjon. Vårt in vitro NMJ induksjonssystem er konstruert ved å differensiere menneskelig iPSC i en enkelt kulturrett. Ved å bytte myogen og nevrogen induksjonsmedium for induksjon, inneholdt den resulterende NMJ pre- og post-synaptiske komponenter, inkludert motornevroner, skjelettmuskulatur og Schwann celler i en måneds kultur. Den funksjonelle analysen av NMJ viste også at myotubes sammentrekning kan utløses av Ca++ deretter hemmet av curare, en acetylkolin reseptor (AChR) hemmer, der stimulerende signalet overføres gjennom NMJ. Denne enkle og robuste tilnærmingen fikk den komplekse strukturen til NMJ med funksjonell tilkobling. Denne in vitro human NMJ, med sine integrerte strukturer og funksjon, har lovende potensial for å studere patologiske mekanismer og sammensatt screening.
Det nevromuskulære krysset (NMJ) er en spesialisert synapse som overfører signaler fra motornevroner til skjelettmuskler for å kontrollere frivillig muskelbevegelse1,,2. Denne synapsen består av pre- og post-synaptiske deler. I den presynaptiske delen frigjør motorneuronet acetylkolin (ACh) fra synaptiske vesikler ved eksocytose. ACh frigjøres fra synaptiske vesikler for å krysse den synaptiske kløften og binde til AChR på den postsynaptiske delen for å utløse et handlingspotensial for muskelsammentrekning3,4. Enhver funksjonsfeil i denne delikate strukturen kan forårsake NMJ sykdommer, inkludert spinal muskelatrofi (SMA), medfødte myasthenic syndromer (CMS), myasthenia gravis (MG)5,,6,,7, etc. Disse sykdommene skader kvaliteten på pasientenes liv og har dessverre ingen effektive behandlingstilnærminger på grunn av mangel på forståelse av den patologiske mekanismen. I denne studien hadde vi som mål å generere in vitro human NMJ fra humane iPSCer for nøyaktig sykdomsmodellering og for terapeutisk forbindelser screening.
Tidligere studier har vist muligheten for å generere in vitro NMJ ved co-kultur strategier. Motornevronene og skjelettalonene genereres henholdsvis. De to celletypene kan genereres fra menneskelige eller mus primære vevkulturer eller induseres frastamceller 8,,9,,10,,11 og deretter co-kultivert for NMJ formasjon. De videre programmene inkluderer sammenslåing av co-kultivert NMJ til mikrofluidiske 3D-enheter og å bruke optogenetiske enheter for kvantifiserbare funksjonelle analyser12,,13. Disse strategiene tar imidlertid en lang kulturperiode og krever kamp for å få de primære komponentene i NMJ, enten motorneuronen eller skjelett myotuben samtidig. Enda en viktig komponent i NMJ, Schwann-cellen, kan ikke genereres i disse kultursystemene. Det avanserte kultursystemet som inneholder myotube-, motorneuron- og Schwann-cellen er ønskelig, da det kan tilby en pålitelig og robust modell for NMJ-studier.
Myogen differensiering 1 (MYOD1) er en velkjent myogen regulator for myogenese14. Den effektive myogen differensieringsmetoden som brukte MYOD1 til å drive iPSC inn i myotubes ble bygget i en tidligere studie15. Derfor induserte vi myorørene ved å overuttrykke MYOD1 i iPSCs15, og høy effektivitet av myogen differensiering ble vist. Interessant, nevronceller dukket opp sammen med myotubes spontant etter dag 10. Utseendet til nevronceller i myogen kultur har ført oss til å utvikle strategien for å generere in vitro NMJ i en enkelt tallerken. Her gir vi en strategi for å generere NMJs ved å overuttrykke MYOD1 i menneskelige iPSCer for myogen og motor neuron induksjon i samme kulturrett. Motornevronene induseres spontant med flere nevrotrofiske faktorer (GDNF, BDNF, NT3 osv.) 8, og i mellomtiden kan Schwann-cellene også induseres16,17. Gjennom interaksjonene mellom myorørene, motornevronene og Schwann-cellene dannes den modne NMJ18. Denne metoden kan generere funksjonell NMJ effektivt, slik at den potensielle studien av patologiske mekanismer og terapeutisk sammensatt screening.
Tidligere studier har rapportert metoder for NMJ formasjon in vitro med sofistikerte metoder som krever langsiktig kultur8,10,12,13,20. Disse prestasjonene leder utviklingen av in vitro NMJ. De kompliserte metodene hindret imidlertid tilgangen til NMJ-studier. Vår protokoll unngår co-kultur for å generere NMJs effektivt og robust i en enkelt brønn. Tre celletyper i NMJ ble observert i vårt induksjonssystem, inkludert myorørene, motornevronene og Schwann-cellene18. I tillegg ble moden morfologi og funksjon verifisert.
Basert på vår forrige studie er den første celletettheten en kritisk faktor for NMJ-dannelse, og ulike celletettheter induserer ulike antall NMJs i kulturen18. En lav celletetthet (< 1 x 104/cm2) induserte et lavt antall nevroner, noe som er ugunstig for NMJ-dannelse. Selv om det ville ta mye mer tid og ressurser å forberede en høyere tetthet av celler (> 1 x 105/ cm2),anbefaler vi at celletettheten er mellom 1,5 x 104/ cm2 og 5 x 104/ cm2 ved hjelp av vår protokoll. NMJ generert av denne protokollen er et heterogent vev med flere celletyper som er nærmere å etterligne fysiologiske forhold. Myotubes er funnet å jevnt distribuere på en kulturrett, men motornevronene vises tilfeldig, hvorav fenomenet resulterer i ujevnt fordeling av NMJs i en kultur. Denne NMJ er egnet for kvalitative studier i stedet for analysen som krever homogene kultursystemer. Vi brukte også andre cellelinjer, eq., H9 (ES cellelinje)18 og A11 (iPS cellelinje, data som ikke vises) for å generere NMJ ved denne protokollen. NMJ kan genereres i morfologi og funksjon. Kulturtilstanden må likevel optimaliseres for ulike cellelinjer.
Den kjemisk utløste myotubes sammentrekning og curare-avhengige hemming bekreftet at vår in vitro NMJ var funksjonell og kan potensielt brukes for praktiske analyser. Spontane muskelsammentrekninger ble observert tilfeldig ved 3\u20124 uker med kultur, men det kunne unngås ved å forlenge kulturtiden til så lenge som to måneder18.
Ulike strategier har blitt publisert for å generere in vitro NMJ av ulike modningsstadier, men in vitro NMJ generert i vårt system viste den betydelige modenheten, da vi kan observere overgangen av gamma til epsilon underenheter av AChR under kulturen18. Modenhet er en viktig faktor for sykdomsmodellering med in vitro NMJ21. Til slutt er en in vitro NMJ med integrerte strukturelle komponenter, modenhet og funksjon til potensiell bruk for terapeutisk utvikling.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Sakurai for vennlig å gi 201B7MYOD. Elektronmikroskopistudien ble støttet av Keiko Okamoto-Furuta og Haruyasu Kohda (Divisjon for elektronmikroskopisk studie, Senter for anatomiske studier, Graduate School of Medicine, Universitetet i Kyoto). Monoklonalt antistoff ble utviklet av HHMI / Columbia University, hentet fra Developmental Studies Hybridoma Bank, opprettet av National Institute Child Health and Human Development of the NIH, og opprettholdt ved Institutt for biologi, University of Iowa. Vi takker også Shiori Oshima, Kazuhiro Nakagawa og Eriko Matsui for bevegelsesvektoranalyse. Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI, tilskuddsnummer 16H05352 og 20H03642 (til MKS); iPS Cell Research Fund (til CYL og MKS); Mochida Memorial Foundation for medisinsk og farmasøytisk forskning (til MKS); Takeda Science Foundation (til MKS); og et stipend fra The Program for Intractable Diseases Research ved hjelp av sykdomsspesifikke iPS-celler, som ble hjulpet av Japan Agency for Medical Research and Development (17935400 til CYL og MKS, og 17935423 til MKS).
Medium, growth factors and reagents | Item | Brand | Cat. Number |
2-mercaptoethanol | Nacalai tesque | 21418-42 | |
B27, Gibco | Gibco | 12587-001 | |
BDNF | R & D Systems | 248-BD | |
Cell detachment solution, Accumax | STEMCELL Technologies | #07921 | |
Critical point dryer | Hitachi | ES-2030 | |
Doxycycline | Takara | 631311 | |
ECM, Matrigel (growth factor reduced) | Corning | 356230 | |
GDNF | R & D Systems | 212-GD | |
Gelation, IP gel | Geno Staff | PG20-1 | |
Ions coater | JEOL | JEC3000FC | |
iPSC medium, mTeSR | STEMCELL Technologies | 85850 | |
KnockOut SR (KSR) | Gibco | 10828-028 | |
live cell microscopy | Nikon | Eclipse Ti microscope | |
MEM-alpha | Gibco | 12571-071 | |
Motion vector analysis software | Sony | SI8000 | |
N2, Gibco | Gibco | 17502-048 | |
Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
NT3 | R & D Systems | 267-N3 | |
Primate ES cell medium | ReproCell | RCHEMD001 | |
SEM | Hitachi | S-4700 | |
TEM | Hitachi | H7650 | |
Y27632 | Wako Chemicals GmbH | 253-00513 | |
Antibodies | Brand | Cat. Number | Dilutions |
Molecular Probes | B3545 | 0.5 ug/ml | |
Islet 1 | DSHB | 40.2D6 | 1/100 |
Myosin heavy chain (MYH) | MilliporeSigma | A4.1025 | 1/300 |
Neurofilaments (NF) | MilliporeSigma | MAB5254 | 1/500 |
S-100 | Abcam | ab14849 | 1/300 |
Synaptic vesicle protein 2 (SV2) | DSHB | SV2 | 1/50 |
Tuj1 | Covance | MMS435P | 1/1000 |