Kultur av neurosfærer avledet fra nevrogene nisjer i Voksen Prairie Voles
Summary
Vi etablerte betingelsene for å dyrke nevrale stamceller fra subventrikulær sone og bulke gyrus av den voksne hjernen til prærievoles, som en komplementær in vitro-studie, for å analysere de kjønnsavhengige forskjellene mellom nevrogene nisjer som kan være en del av funksjonelle plastendringer forbundet med sosial atferd.
Abstract
Nevrosfærer er primære celleaggregater som omfatter nevrale stamceller og stamceller. Disse 3D-strukturene er et utmerket verktøy for å bestemme differensierings- og spredningspotensialet til nevrale stamceller, samt å generere cellelinjer enn det som kan analyseres over tid. Også, neurosfærer kan skape en nisje (in vitro) som tillater modellering av det dynamiske skiftende miljøet, for eksempel varierende vekstfaktorer, hormoner, nevrotransmittere, blant andre. Microtus ochrogaster (prærievole) er en unik modell for å forstå det nevrobiologiske grunnlaget for sosio-seksuell atferd og sosial kognisjon. Cellulære mekanismer som er involvert i disse atferdene er imidlertid ikke godt kjent. Protokollen tar sikte på å få nevrale stamceller fra de nevrogene nisjene til den voksne prærievole, som er dyrket under ikke-tilklutnende forhold, for å generere nevrosfærer. Størrelsen og antall neurosfærer avhenger av regionen (subventrikulær sone eller bulke gyrus) og sex av prærievole. Denne metoden er et bemerkelsesverdig verktøy for å studere kjønnsavhengige forskjeller i nevrogene nisjer in vitro og nevroplastisitetsendringer forbundet med sosial atferd som parbinding og biparental omsorg. Også kognitive forhold som medfører underskudd i sosiale interaksjoner (autismespekterforstyrrelser og schizofreni) kan undersøkes.
Introduction
Prærievole (Microtus ochrogaster), medlem av Cricetidae-familien, er et lite pattedyr hvis livsstrategi utvikler seg som en sosialt monogam og svært omgjengelig art. Både menn og kvinner etablerer et varig parbånd etter parring eller lange perioder med samboerskap preget av å dele reiret, forsvare sitt territorium og vise biparental omsorg for deres avkom1,2,3,4. Dermed er prærievole en verdifull modell for å forstå det nevrobiologiske grunnlaget for sosio-seksuell atferd og funksjonsnedsettering i sosial kognisjon5.
Voksen nevrogenese er en av de mest avgjørende prosessene med neural plastisitet som fører til atferdsendringer. For eksempel rapporterte vår forskningsgruppe i mannlige voles at sosial samboerskap med parring økte cellespredning i subventrikulær sone (VZ) og subgranulær sone i dentate gyrus (DG) av hippocampus, noe som tyder på at voksen nevrogenese kan spille en rolle i dannelsen av parbinding indusert ved parring i prærievoles (upubliserte data). På den annen side, selv om hjerneområdene der nye nevroner genereres og integreres er velkjente, forblir molekylære og cellulære mekanismer som er involvert i disse prosessene ubestemte på grunn av tekniske ulemper i hele hjernemodellen6. For eksempel har signalveiene som kontrollerer genuttrykk og andre cellulære aktiviteter en relativt kort aktiveringsperiode (påvisning av fosfoproteom)7. En alternativ modell er isolert og kultivert voksen nevrale stamceller eller stamceller for å belyse molekylære komponenter involvert i voksen nevrogenese.
Den første tilnærmingen til å opprettholde in vitro nevrale forløpere fra voksen pattedyr (mus) hjernen var analysen av nøyrosfærer, som er cellulære aggregater vokser under ikke-tilhenger forhold som bevarer deres multipotente potensial til å generere nevroner, samt astrocytter8,9,10. Under utviklingen er det en utvelgelsesprosess der bare forløperne vil reagere på mitogener som Epidermal Growth Factor (EGF) og Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) for å spre og generere nevrosfærer8,9,10.
Så vidt vi vet, rapporteres ingen protokoll i litteraturen for å få voksne nevrale forfedre fra prærievoles. Her etablerte vi kulturforholdene for å isolere nevronale forfedre fra nevrogene nisjer og deres in vitro-vedlikehold gjennom nevrosfæreformasjonsanalysen. Dermed kan eksperimenter utformes for å identifisere molekylære og cellulære mekanismer som er involvert i spredning, migrasjon, differensiering og overlevelse av nevrale stamceller og forfedre, prosesser som fortsatt er ukjente i prærievole. Videre kan belyse in vitro forskjeller i egenskapene til cellene avledet fra VZ og DG gi informasjon om rollen som nevrogene nisjer i neural plastisitet forbundet med endringer i sosio-seksuell atferd og kognitiv atferd, og underskudd i sosiale interaksjoner (autismespekterforstyrrelse og schizofreni), som også kan være kjønnsavhengig.
Protocol
Representative Results
Discussion
Et stadium for å oppnå en nevrale stamcellekultur er fordøyelsesperioden med den enzymatiske løsningen, som ikke bør overstige mer enn 30 min fordi det kan redusere celle levedyktigheten. Nevrosfærene bør dukke opp på 8-10 dager etter innledende kultur; hvis de ikke kommer frem innen dag 12, kast kulturen og gjenta eksperimentet, og reduser fordøyelsesperioden. Et annet problem er blodårene som dekker hjernevevet. De bør fjernes helt under disseksjonen fordi overskuddet av erytrocytter kan forstyrre neurosfær…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet av tilskudd CONACYT 252756 og 253631; UNAM-DGAPA-PAPIIT IN202818 og IN203518; INPER 2018-1-163 og NIH P51OD11132. Vi takker Deisy Gasca, Carlos Lozano, Martín García, Alejandra Castilla, Nidia Hernandez, Jessica Norris og Susana Castro for deres utmerkede tekniske hjelp.
Materials
| Antibodies | Antibody ID | ||
| Anti-Nestin | GeneTex | GTX30671 | RRID:AB_625325 |
| Anti-Doublecortin | MERCK | AB2253 | RRID:AB_1586992 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab66155 | RRID:AB_1140752 |
| Anti-MAP2 | GeneTex | GTX50810 | RRID:AB_11170769 |
| Anti-GFAP | SIGMA | G3893 | RRID:AB_477010 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11073 | RRID:AB_2534117 |
| Culture reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17504044 | 50X |
| Collagenase, Type IV | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17104019 | Powder |
| Dispase | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17105041 | Powder |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11330032 | |
| Glucose | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 35050061 | 100X |
| HEPES | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | 1 mg/mL |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17502048 | 100X |
| NAHCO3 | any brand | Powder, Suitable for Cell Culture | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21103049 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | Powder |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | AF-100-18B | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific/Gibco | A1110501 | 100 mL |
| Disposable material | |||
| 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3473 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 40 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352340 | Blue |
| Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore | Corning | 431118 | PES membrane, 45 mm diameter neck |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | any brand | ||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL | any brand | ||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Syringe Filters, 0.22 µm pore | Merk Millipore | SLGPR33RB | Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter |
| Equipment and surgical instruments | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Dumont Forceps | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Micropipettes | |||
| Petri Dishes | |||
| Scalpel Blades | |||
| Stainless-steel Spatula |
Riferimenti
- Portillo, W., Paredes, R. G. Motivational Drive in Non-copulating and Socially Monogamous Mammals. Frontiers Behavioral Neuroscience. 13, 238 (2019).
- Walum, H., Young, L. J. The neural mechanisms and circuitry of the pair bond. Nature Reviews Neurosciences. 19 (11), 643-654 (2018).
- Gobrogge, K. L. Sex, drugs, and violence: neuromodulation of attachment and conflict in voles. Current Topics Behavioral Neurosciences. 17, 229-264 (2014).
- Perkeybile, A. M., Bales, K. L. Intergenerational transmission of sociality: the role of parents in shaping social behavior in monogamous and non-monogamous species. Journal of Experimental Biology. 220, 114-123 (2017).
- McGraw, L. A., Young, L. J. The prairie vole: an emerging model organism for understanding the social brain. Trends in Neuroscience. 33 (2), 103-109 (2010).
- Fowler, C. D., Liu, Y., Ouimet, C., Wang, Z. The effects of social environment on adult neurogenesis in the female prairie vole. Journal of Neurobiology. 51 (2), 115-128 (2002).
- Yang, P., et al. Multi-omic Profiling Reveals Dynamics of the Phased Progression of Pluripotency. Cell Systems. 8 (5), 427-445 (2019).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. Journal of Neurosciences. 16 (3), 1091-1100 (1996).
- Ostenfeld, T., Svendsen, C. N. Requirement for neurogenesis to proceed through the division of neuronal progenitors following differentiation of epidermal growth factor and fibroblast growth factor-2-responsive human neural stem cells. Stem Cells. 22 (5), 798-811 (2004).
- Paxinos, G., Keith, B. J. F. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).
- Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities. Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).
- Lieberwirth, C., Liu, Y., Jia, X., Wang, Z. Social isolation impairs adult neurogenesis in the limbic system and alters behaviors in female prairie voles. Hormones and Behavior. 62 (4), 357-366 (2012).
- Ruscio, M. G., et al. Pup exposure elicits hippocampal cell proliferation in the prairie vole. Behavioral Brain Research. 187 (1), 9-16 (2008).
- Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
- Eack, S. M., et al. Commonalities in social and non-social cognitive impairments in adults with autism spectrum disorder and schizophrenia. Schizophrenia Research. 148 (1-3), 24-28 (2013).
- Pinkham, A. E., et al. Comprehensive comparison of social cognitive performance in autism spectrum disorder and schizophrenia. Psychological Medicine. , 1-9 (2019).
- Yirmiya, N., et al. Association between the arginine vasopressin 1a receptor (AVPR1a) gene and autism in a family-based study: mediation by socialization skills. Molecular Psychiatry. 11 (5), 488-494 (2006).
- Montag, C., et al. Oxytocin and oxytocin receptor gene polymorphisms and risk for schizophrenia: a case-control study. The World Journal of Biological Psychiatry. 14 (7), 500-508 (2013).
- Harony, H., Wagner, S. The contribution of oxytocin and vasopressin to mammalian social behavior: potential role in autism spectrum disorder. Neurosignals. 18 (2), 82-97 (2010).
- Bachner-Melman, R., Ebstein, R. P. The role of oxytocin and vasopressin in emotional and social behaviors. Handbook of Clinical Neurology. 124, 53-68 (2014).
- Wegiel, J., et al. The neuropathology of autism: defects of neurogenesis and neuronal migration, and dysplastic changes. Acta Neuropathologica. 119 (6), 755-770 (2010).
- Kaushik, G., Zarbalis, K. S. Prenatal Neurogenesis in Autism Spectrum Disorders. Frontiers in Chemistry. 4, 12 (2016).
- Sheu, J. R., et al. A Critical Period for the Development of Schizophrenia-Like Pathology by Aberrant Postnatal Neurogenesis. Frontiers in Neuroscience. 13, 635 (2019).
- Donaldson, Z. R., Young, L. J. The relative contribution of proximal 5′ flanking sequence and microsatellite variation on brain vasopressin 1a receptor (Avpr1a) gene expression and behavior. PLoS Genetics. 9 (8), 1003729 (2013).
- Rice, M. A., Hobbs, L. E., Wallace, K. J., Ophir, A. G. Cryptic sexual dimorphism in spatial memory and hippocampal oxytocin receptors in prairie voles (Microtus ochrogaster). Hormones and Behavior. 95, 94-102 (2017).
