Este protocolo permite a preparação de seções transversais de sementes de cereal (por exemplo, arroz) para a análise da morfologia do endosperma e do grânulo de amido usando microscopia eletrônica de varredura.
Os grânulos de amido (SGs) exibem diferentes morfologias dependendo da espécie vegetal, especialmente no endosperma da família Poaceae. O fenotismo endosperm pode ser usado para classificar genótipos baseados no morótipo SG usando a análise microscópica eletrônica de varredura (SEM). Os SGs podem ser visualizados usando SEM cortando através do kernel (pericarp, camadas de aleurone e endosperm) e expondo o conteúdo organellar. Os métodos atuais exigem que o grão de arroz seja embutido em resina plástica e seccionado usando um microtome ou embutido em uma ponta de pipeta truncada e seccionado à mão usando uma lâmina de barbear. O método anterior requer equipamentos especializados e é demorado, enquanto este apresenta uma nova série de problemas dependendo do genótipo do arroz. As variedades de arroz chalky, particularmente, representam um problema para este tipo de secção devido à natureza friável de seu tecido endosperm. Apresentada aqui é uma técnica para preparar seções de grãos de arroz translúcidos e calcâneos para microscopia, exigindo apenas pontas de pipeta e uma lâmina de bisturi. Preparar as seções dentro dos limites de uma ponta de pipeta evita que o endosperm do grão de arroz se quebre (para fenótipos translúcidos ou ‘vítreos’ ) e desmorone (para fenótipos chalky). Utilizando esta técnica, pode-se observar a padronização celular endosperm e a estrutura de SGs intactas.
Os grânulos de amido (SGs) apresentam diferentes morfologias dependendo da espécie vegetal, especialmente no endosperma da família Poaceae 1,2. Fenotipos de endosperm podem ser usados para classificar genótipos baseados no fenótipo SG usando análise microscópica eletrônica de varredura. Os SGs podem ser visualizados usando microscopia eletrônica de varredura (SEM) cortando o kernel e afastando as paredes celulares endosperm2.
O objetivo desta técnica é preparar facilmente seções transversais de grãos de arroz apenas para a rápida análise sem. O desenvolvimento dessa técnica foi motivado pela necessidade de uma abordagem transversal rápida em que as amostras são preparadas para microscopia SEM imediatamente antes da visualização utilizando equipamentos mínimos.
Esta técnica envolve a inserção do grão de arroz cascado na ponta da pipeta para a imobilização completa. Isso é particularmente importante quando seção transversal fenótipos de grão de arroz chalky, que são friáveis e facilmente desmoronam sob pressão3. A calcidez é uma qualidade indesejável no arroz, pois afeta o aparecimento do grão e faz com que o kernel quebre facilmente durante o polimento e moagem3. Chalkiness apresenta-se como uma área opaca em uma seção transversal do kernel que pode ser observada a olho nu; no nível microscópico, a chalkiness é caracterizada por pequenos grânulos de amido embalados. As causas da chalkiness podem sergenéticas 4,5 ou ambientais6,7.
As seções transversais de sementes de cereal têm sido tradicionalmente preparadas usando métodos de fixação química e secção após a incorporação da amostra em cera de parafina ou outra matriz sólida4,8,9,10. Em 2010, o método Matsushima foi introduzido como uma forma de evitar a preparação complicada e demorada da amostra de grãos de arroz4. Este método envolveu a inserção do grão de arroz cascado em uma ponta de pipeta truncada. A ponta é mantida estacionária por um aparador de blocos, e seções finas e parciais de endospermia são colhidas usando uma lâmina de barbear portátil. Outra técnica rápida desenvolvida em 2016 permitiu a secção integral fina de uma grande variedade de sementes secas, incluindo variedades de calcinhas10. Esses métodos motivaram o desenvolvimento da técnica rápida aqui apresentada.
Esta nova técnica é apropriada para pesquisadores que desejam obter seções transversais intactas de grãos de arroz para fenotipagem e endosperma e análise de morfologia de amido usando SEM.
Este protocolo representa uma adaptação do método de ponta de pipeta truncada de Matsushima4, com várias modificações notáveis: (1) os grãos não são absorvidos em nenhum ponto da técnica; (2) nem um aparador de blocos nem um ultramicrotome são necessários para preparar as seções. Um tipo selvagem de cultivar ‘translúcido’(Oryza sativa L. sp. japonica cv. Nipponbare) e uma linha “chalky” mutagenizada de Nipponbare(ssg1, grão de amido subpadrão1)4 foram examinados neste estudo. Estas duas cultivares foram selecionadas para a análise aqui para demonstrar as diferenças técnicas e visuais no processamento de seções de arroz translúcida e chalky.
A técnica aqui apresentada representa uma abordagem rápida, simples e aguçada para preparar seções transversais de arroz transversal para visualização SEM desktop. Esta técnica de secção permite a observação rápida da estrutura do endosperma, forma celular endosperma, tamanho e padrão, grânulos compostos e morfologia do amido. Para efeitos de fenotipagem e germoplasma e endosperm, é fundamental obter uma seção transversal inteira do grão de arroz4,23,24. É primordial inserir o kernel inteiramente dentro da ponta da pipeta para evitar que a pressão da lâmina do bisturi force o endosperm a desmoronar ou quebrar. Desde que o conjunto do “telescópio” seja devidamente construído, as amostras podem ser preparadas para visualização dentro de 15 segundos(Tabela 2) empregando materiais já em mãos em um ambiente típico de laboratório. Esta técnica é aplicável à secção transversal de qualquer semente elipsoidal de aproximadamente quatro milímetros de diâmetro em seu ponto mais largo. As sementes da grama modelo Brachypodium distachyon (Figura S2A) podem ser igualmente seccionadas, mas não permanecem fechadas dentro do anulo. Sementes maiores, como trigo, fraturam facilmente e requerem cuidados ao seção(Figura S2B).
No entanto, existem várias limitações à técnica aqui apresentadas. As seções obtidas usando esta técnica não são finas o suficiente para que a luz passe, que proíbe o uso desta técnica para abordagens microscópicas baseadas em luz transmitida, como campo brilhante (espessura máxima da amostra de 500 μm para seções de grãos de arroz25) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM) (500 nm de espessura máxima da amostra26 ). O uso de uma ponta de pipeta como a “matriz” de secção também limita o tamanho da semente que pode ser seccionada usando esta técnica. Mais solução de problemas seria necessária para adaptar essa técnica para espécies altamente diferentes do arroz, e o tamanho da ‘matriz’ é limitado pelo tamanho das pontas de pipeta disponíveis para compra.
Outra vantagem distinta que esta técnica proporciona é a qualidade das amostras que podem ser produzidas a partir de grãos de arroz de fenótipo chalky. Vale ressaltar que mesmo o estudo de Matsushima admitiu que era difícil obter seções transversais utilizando esse método específico para fenótiposcalcários 4, replicados neste estudo para fins de comparação(Figura 1S). No caso deles, tornou-se necessário fixar quimicamente suas amostras de arroz calcário e incorporá-las em resina para secção. A nova técnica, em conjunto com a imagem SEM desktop, permite ao pesquisador preparar facilmente seções transversais de grãos de arroz para microscopia com mais consistência do que sem suporte à imobilização(Tabela 3).
Na nova era da fenômica e metabolômica, é importante monitorar linhas mutagenizadas e bibliotecas marcadas por transposon para entender melhor a função e a importância do amido nas sementes. Além disso, o International Rice Genebank possui mais de 130.000 adesões de arroz27. Uma técnica rápida de fenotipagem de sementes como a apresentada aqui agilizaria a classificação e amostragem para a qualidade nutricional28. Por fim, essa técnica pode ser útil à luz dos impactos das mudanças climáticas. O estresse sazonal de alta temperatura durante o enchimento de grãos já havia sido identificado como uma das principais causas de chalkiness6, mas estudos recentes implicaram o aumento das temperaturas globais no aumento da calcidez da produção de arroz7,29. Esse fenotipagem acelerada de endosperm pode ajudar a fornecer uma imagem agrícola ampla do efeito do aumento das temperaturas globais.
The authors have nothing to disclose.
Os autores são gratos à Systems for Research (SFR Corp.) pelo uso de seu instrumento Phenom ProX Desktop SEM, bem como pela assistência técnica prestada por Maria Pilarinos (Systems for Research (SFR) Corp.) e Chloë van Oostende-Triplet (Cell Biology and Image Acquisition Core Facility, Faculdade de Medicina da Universidade de Ottawa). O financiamento foi fornecido pelo Fundo de Inovação de Baixo Carbono (LCIF) do Ministério do Desenvolvimento Econômico, Criação de Empregos e Comércio de Ontário e Proteínas Easy Corp.
JMP 15 | SAS | N/A | N/A |
Leit Adhesive Carbon Tabs 12 mm (Pack of 100) | Agar Scientific | AGG3347N | N/A |
Phenom Pro Desktop SEM | Thermo Scientific | PHENOM-PRO | N/A |
Pipette Tips RC UNV 250 µL | Rainin | 17001116 | N/A |
SEM Pin Stub Ø12.7 Diameter Top, Standard Pin, Aluminium | Micro to Nano | 10-002012-50 | N/A |
Shandon Microdissecting Fine Tips Thumb Forceps, Fine Tips, 12.7 cm | Thermo Scientific | 3120019 | N/A |
Shandon Scalpel Blade No. 20, Sterile, 4.5 cm | Thermo Scientific | 28618256 | N/A |
Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle | Thermo Scientific | 5334 | N/A |
Zeiss V20 Discovery Stereomicroscope | Zeiss | N/A | N/A |