Ce protocole permet la préparation de sections transversales de graines de céréales (par exemple, le riz) pour l’analyse de la morphologie des endospermes et des granules d’amidon à l’aide de la microscopie électronique à balayage.
Les granules d’amidon (SG) présentent des morphologies différentes selon les espèces végétales, en particulier chez l’endosperme de la famille des Poaceae. Le phénotypage des endospermes peut être utilisé pour classer les génotypes en fonction du morphotype SG à l’aide d’une analyse microscopique électronique à balayage (MEB). Les SG peuvent être visualisés à l’aide de SEM en tranchant à travers le noyau (péricarpe, couches d’aleurone et endosperme) et en exposant le contenu organellaire. Les méthodes actuelles exigent que le noyau de riz soit incorporé dans une résine plastique et sectionné à l’aide d’un microtome ou incorporé dans une pointe de pipette tronquée et sectionné à la main à l’aide d’une lame de rasoir. La première méthode nécessite un équipement spécialisé et prend beaucoup de temps, tandis que la seconde introduit une nouvelle série de problèmes en fonction du génotype du riz. Les variétés de riz crayeux, en particulier, posent un problème pour ce type de sectionnement en raison de la nature friable de leur tissu endosperme. Présenté ici est une technique pour préparer des sections de grains de riz translucides et crayeux pour la microscopie, ne nécessitant que des pointes de pipette et une lame de scalpel. La préparation des sections dans les limites d’une pointe de pipette empêche l’endosperme du noyau de riz de se briser (pour les phénotypes translucides ou « vitreux ») et de s’effriter (pour les phénotypes crayeux). En utilisant cette technique, on peut observer le motif des cellules endospermes et la structure des SG intacts.
Les granules d’amidon (SG) présentent des morphologies différentes selon les espèces végétales, en particulier chez les endospermes de la famille des Poaceae 1,2. Le phénotypage des endospermes peut être utilisé pour classer les génotypes en fonction du phénotype SG à l’aide d’une analyse microscopique électronique à balayage. Les SG peuvent être visualisés à l’aide de la microscopie électronique à balayage (MEB) en tranchant le noyau et en évinçant les parois cellulaires de l’endosperme2.
Le but de cette technique est de préparer facilement des sections transversales de grains de riz uniquement pour l’analyse SEM rapide. Le développement de cette technique a été motivé par la nécessité d’une approche de coupe transversale rapide dans laquelle les échantillons sont préparés pour la microscopie SEM immédiatement avant la visualisation à l’aide d’un équipement minimal.
Cette technique implique l’insertion du grain de riz décortiqué dans la pointe de la pipette pour une immobilisation complète. Ceci est particulièrement important lors de la coupe transversale des phénotypes de noyau de riz crayeux, qui sont friables et s’effritent facilement sous pression3. La craie est une qualité indésirable dans le riz car elle affecte l’apparence de l’amande et provoque la rupture facile de l’amande lors du polissage et du broyage3. La craie se présente comme une zone opaque dans une section transversale du noyau qui peut être observée à l’œil nu; au niveau microscopique, la craie est caractérisée par de petits granules d’amidon lâchement emballés. Les causes de la craie peuvent êtregénétiques4,5 ouenvironnementales 6,7.
Les coupes transversales de semences de céréales ont traditionnellement été préparées à l’aide de méthodes de fixation chimique et de sectionnement après l’incorporation de l’échantillon dans de la cire de paraffine ou une autre matrice solide4,8,9,10. En 2010, la méthode Matsushima a été introduite comme un moyen d’éviter la préparation compliquée et fastidieuse d’échantillons de grains de riz4. Cette méthode impliquait l’insertion du grain de riz décortiqué dans une pointe de pipette tronquée. La pointe est maintenue immobile par une tondeuse à blocs et de fines sections partielles d’endosperme sont récoltées à l’aide d’une lame de rasoir portative. Une autre technique rapide développée en 2016 a permis de sectionner toutes une grande variété de graines sèches, y compris des variétés crayeuses10. Ces méthodes ont motivé le développement de la technique rapide présentée ici.
Cette nouvelle technique convient aux chercheurs qui souhaitent obtenir des coupes transversales intactes de grains de riz pour le phénotypage des endospermes et l’analyse de la morphologie de l’amidon à l’aide de SEM.
Ce protocole représente une adaptation de la méthode4de la pointe de pipette tronquée de Matsushima, avec plusieurs modifications notables : (1) les amandes ne sont absorbées à aucun point de la technique ; 2° ni une tondeuse à blocs ni un ultramicrotome ne sont nécessaires pour préparer les sections. Un cultivar « translucide » de type sauvage (Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare) et une lignée mutagénisée « crayeuse » de Nipponbare (ssg1, grain d’amidon de qualité inférieure1)4 ont été examinés dans cette étude. Ces deux cultivars ont été sélectionnés pour l’analyse ici afin de démontrer les différences techniques et visuelles dans le traitement des sections de riz translucides et crayeux.
La technique présentée ici représente une approche rapide, simple et précise de la préparation de coupes transversales de riz pour la visualisation SEM de bureau. Cette technique de sectionnement permet l’observation rapide de la structure de l’endosperme, de la forme, de la taille et du motif des cellules de l’endosperme, des granules composés et de la morphologie de l’amidon. Aux fins du phénotypage de l’endosperme et du dépistage du matériel génétique, il est essentiel d’obtenir une section transversale entière du noyau de riz4,23,24. Il est primordial d’insérer le noyau entièrement dans l’extrémité de la pipette pour éviter que la pression de la lame du scalpel ne force l’endosperme à s’effriter ou à se briser. À condition que l’assemblage du « télescope » soit correctement construit, les échantillons peuvent être préparés pour la visualisation dans les 15 secondes(tableau 2)en utilisant des matériaux déjà en main dans un environnement de laboratoire typique. Cette technique est applicable à la coupe transversale de toute graine ellipsoïdale d’environ quatre millimètres de diamètre à son point le plus large. Les graines de l’herbe modèle Brachypodium distachyon (Figure S2A) peuvent être sectionnées de la même manière mais ne restent pas enfermées dans l’anneau. Les graines plus grosses, comme le blé, se fracturent facilement et nécessitent des soins lors du sectionnement(figure S2B).
Cependant, il existe plusieurs limites à la technique présentée ici. Les sections obtenues à l’aide de cette technique ne sont pas assez minces pour que la lumière puisse passer, ce qui interdit l’utilisation de cette technique pour les approches microscopiques à base de lumière transmise comme le champ lumineux (épaisseur maximale de l’échantillon de 500 μm pour les sections de grains de riz25)et la microscopie électronique à transmission (TEM) (épaisseur maximale de l’échantillon de 500 nm26 ). L’utilisation d’une pointe de pipette comme « matrice » de sectionnement limite également la taille des graines qui peuvent être sectionnées à l’aide de cette technique. Un dépannage supplémentaire serait nécessaire pour adapter cette technique à des espèces très différentes du riz, et la taille de la « matrice » est limitée par la taille des embouts de pipette disponibles à l’achat.
Un autre avantage distinct de cette technique est la qualité des échantillons qui peuvent être produits à partir de grains de riz phénotypiques crayeux. Il convient de noter que même l’étude de Matsushima a admis qu’il était difficile d’obtenir des coupes transversales en utilisant cette méthode particulière pour les phénotypes crayeux4, tels que reproduits dans cette étude à des fins de comparaison(Figure 1S). Dans leur cas, il est devenu nécessaire de fixer chimiquement leurs échantillons de riz crayeux et de les incorporer dans de la résine pour le sectionnement. La nouvelle technique, associée à l’imagerie SEM de bureau, permet au chercheur de préparer facilement des sections transversales de grains de riz pour la microscopie avec plus de cohérence que sans support d’immobilisation (Tableau 3).
Dans la nouvelle ère de la phénomique et de la métabolomique, il est important de surveiller les lignées mutagénisées et les bibliothèques marquées par transposon pour mieux comprendre la fonction et l’importance de l’amidon dans les graines. En outre, la Banque internationale de gènes du riz détient plus de 130 000 accessions de riz27. Une technique rapide de phénotypage des graines comme celle présentée ici accélérerait la classification et l’échantillonnage pour la qualité nutritionnelle28. Enfin, cette technique peut être utile à la lumière des impacts du changement climatique qui empiètent. Le stress saisonnier à haute température pendant le remplissage des grains avait déjà été identifié comme une cause majeure de craie6, mais des études récentes ont impliqué la hausse des températures mondiales dans l’augmentation de la craie des rendements en riz7,29. Un tel phénotypage accéléré de l’endosperme peut aider à fournir une image agricole large de l’effet de l’augmentation des températures mondiales.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs remercient Systems for Research (SFR Corp.) pour l’utilisation de leur instrument Phenom ProX Desktop SEM, ainsi que pour l’assistance technique fournie par Maria Pilarinos (Systems for Research (SFR) Corp.) et Chloë van Oostende-Triplet (Cell Biology and Image Acquisition Core Facility, Faculté de médecine, Université d’Ottawa). Le financement a été fourni par le Fonds d’innovation à faible émission de carbone (LCIF) du ministère du Développement économique, de la Création d’emplois et du Commerce du gouvernement de l’Ontario et de Proteins Easy Corp.
JMP 15 | SAS | N/A | N/A |
Leit Adhesive Carbon Tabs 12 mm (Pack of 100) | Agar Scientific | AGG3347N | N/A |
Phenom Pro Desktop SEM | Thermo Scientific | PHENOM-PRO | N/A |
Pipette Tips RC UNV 250 µL | Rainin | 17001116 | N/A |
SEM Pin Stub Ø12.7 Diameter Top, Standard Pin, Aluminium | Micro to Nano | 10-002012-50 | N/A |
Shandon Microdissecting Fine Tips Thumb Forceps, Fine Tips, 12.7 cm | Thermo Scientific | 3120019 | N/A |
Shandon Scalpel Blade No. 20, Sterile, 4.5 cm | Thermo Scientific | 28618256 | N/A |
Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle | Thermo Scientific | 5334 | N/A |
Zeiss V20 Discovery Stereomicroscope | Zeiss | N/A | N/A |