यह प्रोटोकॉल स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एंडोस्पर्म और स्टार्च ग्रेन्युल आकृति विज्ञान के विश्लेषण के लिए अनाज के बीज (जैसे, चावल) के अनुप्रस्थ वर्गों की तैयारी के लिए अनुमति देता है।
स्टार्च ग्रैन्यूल्स (एसजी) पौधे की प्रजातियों के आधार पर विभिन्न आकारिकी प्रदर्शित करते हैं, विशेष रूप से पोएसी परिवार के एंडोस्पर्म में। एंडोस्पर्म फेनोटाइपिंग का उपयोग स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक (एसईएम) विश्लेषण का उपयोग करके एसजी मोर्फोटाइप के आधार पर जीनोटाइप को वर्गीकृत करने के लिए किया जा सकता है। एसजी को कर्नेल (पेरिकार्प, एल्यूरोन परतों, और एंडोस्पर्म) के माध्यम से स्लाइसिंग करके और ऑर्गेनेलर सामग्री को उजागर करके एसईएम का उपयोग करके कल्पना की जा सकती है। वर्तमान विधियों के लिए चावल कर्नेल को प्लास्टिक राल में एम्बेडेड करने की आवश्यकता होती है और एक माइक्रोटोम का उपयोग करके विभाजित किया जाता है या एक कटे हुए पिपेट टिप में एम्बेडेड किया जाता है और रेजर ब्लेड का उपयोग करके हाथ से विभाजित किया जाता है। पूर्व विधि के लिए विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है और यह समय लेने वाली होती है, जबकि उत्तरार्द्ध चावल जीनोटाइप के आधार पर समस्याओं का एक नया मेजबान पेश करता है। चॉकी चावल की किस्में, विशेष रूप से, उनके एंडोस्पर्म ऊतक की friable प्रकृति के कारण इस प्रकार के सेक्शनिंग के लिए एक समस्या पैदा करती हैं। यहां प्रस्तुत माइक्रोस्कोपी के लिए पारभासी और चॉकी चावल कर्नेल वर्गों को तैयार करने के लिए एक तकनीक है, जिसमें केवल पिपेट टिप्स और एक स्केलपेल ब्लेड की आवश्यकता होती है। एक पिपेट टिप की सीमाओं के भीतर वर्गों को तैयार करना चावल कर्नेल एंडोस्पर्म को टूटने से रोकता है (पारभासी या ‘विट्रियस’ फेनोटाइप के लिए) और ढहने (चॉकी फेनोटाइप के लिए)। इस तकनीक का उपयोग करते हुए, एंडोस्पर्म सेल पैटर्निंग और बरकरार एसजी की संरचना को देखा जा सकता है।
स्टार्च ग्रैन्यूल्स (एसजी) पौधे की प्रजातियों के आधार पर विभिन्न आकारिकी प्रदर्शित करते हैं, विशेष रूप से पोएसी परिवार1,2के एंडोस्पर्म में। एंडोस्पर्म फेनोटाइपिंग का उपयोग स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक विश्लेषण का उपयोग करके एसजी फेनोटाइप के आधार पर जीनोटाइप को वर्गीकृत करने के लिए किया जा सकता है। एसजी को कर्नेल को टुकड़ा करने और एंडोस्पर्म सेल की दीवारों को दूर करने के द्वारा स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) का उपयोग करके कल्पना की जा सकतीहै।
इस तकनीक का उद्देश्य आसानी से तेजी से SEM विश्लेषण के लिए पूरी तरह से अनुप्रस्थ चावल कर्नेल वर्गों को तैयार करना है। इस तकनीक का विकास एक तेजी से क्रॉस सेक्शनिंग दृष्टिकोण की आवश्यकता से प्रेरित था जिससे नमूने न्यूनतम उपकरणों का उपयोग करके विज़ुअलाइज़ेशन से तुरंत पहले SEM माइक्रोस्कोपी के लिए तैयार किए जाते हैं।
इस तकनीक में पूरी तरह से स्थिरीकरण के लिए पिपेट टिप में भूसी हुई चावल कर्नेल का सम्मिलन शामिल है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब क्रॉस-सेक्शनिंग चॉकी चावल कर्नेल फेनोटाइप, जो फ्रिएबल होते हैं और दबाव3के तहत आसानी से उखड़ जाते हैं। चॉकनेस चावल में एक अवांछनीय गुणवत्ता है क्योंकि यह कर्नेल की उपस्थिति को प्रभावित करता है और चमकाने और मिलिंग के दौरान कर्नेल को आसानी से तोड़ने का कारण बनता है3. चॉकनेस कर्नेल के एक क्रॉस-सेक्शन में एक अपारदर्शी क्षेत्र के रूप में प्रस्तुत करता है जिसे नग्न आंखों से देखा जा सकता है; माइक्रोस्कोपिक स्तर पर, चॉकनेस को छोटे, ढीले पैक स्टार्च दानों की विशेषता है। चॉकीनेस के कारण आनुवांशिक4,5 या पर्यावरणीय 6,7हो सकते हैं .
पैराफिन मोम या एक अन्य ठोस मैट्रिक्स 4 ,8,9,10में नमूने को एम्बेड करने के बाद पारंपरिक रूप से रासायनिक निर्धारण विधियों और सेक्शनिंग का उपयोग करके अनाज बीज क्रॉस सेक्शन तैयार किए गए हैं . 2010 में, मात्सुशिमा विधि को जटिल और समय लेने वाले चावल कर्नेल नमूनातैयारीसे बचने के तरीके के रूप में पेश किया गया था। इस विधि में एक कटा हुआ पिपेट टिप में भूसीदार चावल कर्नेल का सम्मिलन शामिल था। टिप को एक ब्लॉक ट्रिमर द्वारा स्थिर रखा जाता है, और पतले, आंशिक एंडोस्पर्म वर्गों को हाथ से आयोजित रेजर ब्लेड का उपयोग करके काटा जाता है। 2016 में विकसित एक और तेजी से तकनीक ने विभिन्न प्रकार के सूखे बीजों के पतले पूरे विभाजन के लिए अनुमति दी, जिसमें चाकी किस्में10शामिल हैं। इन विधियों ने यहां प्रस्तुत तेजी से तकनीक के विकास को प्रेरित किया।
यह नई तकनीक उन शोधकर्ताओं के लिए उपयुक्त है जो एसईएम का उपयोग करके एंडोस्पर्म फेनोटाइपिंग और स्टार्च आकृति विज्ञान विश्लेषण के लिए चावल की गुठली के बरकरार अनुप्रस्थ क्रॉस सेक्शन प्राप्त करना चाहते हैं।
यह प्रोटोकॉल कई उल्लेखनीय संशोधनों के साथ मात्सुशिमा कटे हुए पिपेट टिप विधि4के अनुकूलन का प्रतिनिधित्व करता है: (1) कर्नेल तकनीक के किसी भी बिंदु पर आत्मसात नहीं किए जाते हैं; (2) अनुभागों को तैयार करने के लिए न तो एक ब्लॉक ट्रिमर और न ही एक अल्ट्रामाइक्रोबियलोम की आवश्यकता होती है। एक जंगली प्रकार ‘पारभासी’ cultivar(Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare) और निप्पॉनबेरे(ssg1, घटिया स्टार्च अनाज1)4 की एक उत्परिवर्तित ‘चॉकी’ लाइन की जांच इस अध्ययन में की गई थी। इन दो cultivars को यहां विश्लेषण के लिए चुना गया था ताकि पारभासी और चॉकी-प्रकार के चावल वर्गों के प्रसंस्करण में तकनीकी और दृश्य अंतर प्रदर्शित किया जा सके।
यहां प्रस्तुत तकनीक डेस्कटॉप एसईएम विज़ुअलाइज़ेशन के लिए अनुप्रस्थ चावल क्रॉस सेक्शन तैयार करने की दिशा में एक तेज़, सरल और उत्सुक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करती है। यह सेक्शनिंग तकनीक एंडोस्पर्म संरचना, एंडोस्पर्म सेल आकार, आकार और पैटर्न, यौगिक दानों और स्टार्च आकृति विज्ञान के तेजी से अवलोकन के लिए अनुमति देती है। एंडोस्पर्म फेनोटाइपिंग और जर्मप्लाज्म स्क्रीनिंग के प्रयोजनों के लिए, चावलकर्नेल4,23,24के पूरे क्रॉस सेक्शन को प्राप्त करना महत्वपूर्ण है। एंडोस्पर्म को उखड़ने या चकनाचूर करने के लिए मजबूर करने से स्केलपेल ब्लेड के दबाव को रोकने के लिए पिपेट टिप के भीतर पूरी तरह से कर्नेल को सम्मिलित करना सर्वोपरि है। बशर्ते ‘दूरबीन’ संयोजन ठीक से बनाया गया है, नमूनों को 15 सेकंड के भीतर विज़ुअलाइज़ेशन के लिए तैयार किया जा सकता है(तालिका 2)एक विशिष्ट प्रयोगशाला सेटिंग में पहले से ही हाथ में सामग्री को नियोजित करना। यह तकनीक किसी भी अंडाकार बीज के क्रॉस-सेक्शनिंग पर लागू होती है जो इसके सबसे व्यापक बिंदु पर लगभग चार मिलीमीटर व्यास में होती है। मॉडल घास Brachypodium distachyon (चित्रा S2A)के बीज इसी तरह से विभाजित किया जा सकता है, लेकिन annulus के भीतर संलग्न नहीं रहते हैं। बड़े बीज, जैसे गेहूं, आसानी से फ्रैक्चर और सेक्शनिंग(चित्रा S2B)करते समय देखभाल की आवश्यकता होती है।
हालांकि, यहां प्रस्तुत तकनीक की कई सीमाएं हैं। इस तकनीक का उपयोग करके प्राप्त अनुभाग प्रकाश के गुजरने के लिए पर्याप्त पतले नहीं हैं, जो उज्ज्वल क्षेत्र (चावल कर्नेल अनुभागों25के लिए 500 μm अधिकतम नमूना मोटाई) और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) (500 एनएम अधिकतम नमूना मोटाई26) जैसे संचारित-प्रकाश आधारित माइक्रोस्कोपिक दृष्टिकोणों के लिए इस तकनीक के उपयोग को प्रतिबंधित करता है। ). सेक्शनिंग ‘मैट्रिक्स’ के रूप में एक पिपेट टिप का उपयोग भी बीज के आकार को सीमित करता है जिसे इस तकनीक का उपयोग करके विभाजित किया जा सकता है। चावल से अत्यधिक असमान प्रजातियों के लिए इस तकनीक को अनुकूलित करने के लिए आगे की समस्या निवारण की आवश्यकता होगी, और ‘मैट्रिक्स’ का आकार खरीद के लिए उपलब्ध पिपेट युक्तियों के आकार से सीमित है।
एक और विशिष्ट लाभ जो यह तकनीक प्रदान करती है वह नमूनों की गुणवत्ता है जिसे चॉकी फेनोटाइप चावल की गुठली से उत्पादित किया जा सकता है। यह ध्यान देने योग्य है कि यहां तक कि मात्सुशिमा अध्ययन ने स्वीकार किया कि चॉकीफेनोटाइप्स 4के लिए उस विशेष विधि का उपयोग करके क्रॉस सेक्शन प्राप्त करना मुश्किल था, जैसा कि तुलना के उद्देश्य से इस अध्ययन में दोहराया गया था(चित्रा 1 एस)। उनके मामले में, रासायनिक रूप से उनके चॉकी चावल के नमूनों को ठीक करना और उन्हें सेक्शनिंग के लिए राल में एम्बेड करना आवश्यक हो गया। नई तकनीक, डेस्कटॉप एसईएम इमेजिंग के साथ संयोजन के रूप में, शोधकर्ता को आसानी से स्थिरीकरण समर्थन के बिना अधिक स्थिरता के साथ माइक्रोस्कोपी के लिए चावल की गुठली के अनुप्रस्थ वर्गों को तैयार करने की अनुमति देती है(तालिका 3)।
Phenomics और metabolomics के नए युग में, बीज में स्टार्च के कार्य और महत्व को बेहतर ढंग से समझने के लिए म्यूटाजेनाइज्ड लाइनों और ट्रांसपोसन-टैग किए गए पुस्तकालयों की निगरानी करना महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, अंतर्राष्ट्रीय चावल जीनबैंक में 130,000 से अधिक चावल परिग्रहण27हैं। यहां प्रस्तुत एक तेजी से बीज फेनोटाइपिंग तकनीक की तरह एक पोषण गुणवत्ता के लिए वर्गीकरण और नमूनाकरण में तेजीलाएगी। अंत में, यह तकनीक जलवायु परिवर्तन के प्रभावों के अतिक्रमण के प्रकाश में उपयोगी हो सकती है। अनाज भरने के दौरान मौसमी उच्च तापमान के तनाव को पहले से ही चॉकनेस6के एक प्रमुख कारण के रूप में पहचाना जा चुका था, लेकिन हाल के अध्ययनों ने चावल की पैदावार7,29की बढ़ती चॉकनेस में बढ़ते वैश्विक तापमान को शामिल किया है। इस तरह के त्वरित एंडोस्पर्म फेनोटाइपिंग वैश्विक तापमान में वृद्धि के प्रभाव की एक व्यापक कृषि छवि प्रदान करने में मदद कर सकते हैं।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों को उनके Phenom ProX डेस्कटॉप SEM साधन के उपयोग के लिए अनुसंधान के लिए सिस्टम (SFR Corp.) के लिए आभारी हैं, साथ ही साथ मारिया Pilarinos (अनुसंधान के लिए प्रणाली (SFR) कॉर्प) और Chloë वैन Oostende-Triplet (सेल जीव विज्ञान और छवि अधिग्रहण कोर सुविधा, चिकित्सा के संकाय, ओटावा विश्वविद्यालय) द्वारा प्रदान की गई तकनीकी सहायता के लिए आभारी हैं। वित्तपोषण ओंटारियो सरकार के आर्थिक विकास, नौकरी सृजन और व्यापार मंत्रालय, और प्रोटीन ईजी कॉर्प से कम कार्बन इनोवेशन फंड (LCIF) द्वारा प्रदान किया गया था।
JMP 15 | SAS | N/A | N/A |
Leit Adhesive Carbon Tabs 12 mm (Pack of 100) | Agar Scientific | AGG3347N | N/A |
Phenom Pro Desktop SEM | Thermo Scientific | PHENOM-PRO | N/A |
Pipette Tips RC UNV 250 µL | Rainin | 17001116 | N/A |
SEM Pin Stub Ø12.7 Diameter Top, Standard Pin, Aluminium | Micro to Nano | 10-002012-50 | N/A |
Shandon Microdissecting Fine Tips Thumb Forceps, Fine Tips, 12.7 cm | Thermo Scientific | 3120019 | N/A |
Shandon Scalpel Blade No. 20, Sterile, 4.5 cm | Thermo Scientific | 28618256 | N/A |
Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle | Thermo Scientific | 5334 | N/A |
Zeiss V20 Discovery Stereomicroscope | Zeiss | N/A | N/A |