Bruk av primærkulturerte hippocampale nevroner for å studere monteringen av axon-innledende segmenter
Summary
Her beskrev vi en protokoll for kvantitativt å studere montering og struktur av axon innledende segmenter (AIS) av hippocampal nevroner som mangler forhåndsmontert AIS på grunn av fravær av en gigantisk ankyrin-G.
Abstract
Neuronal axon innledende segmenter (AIS) er steder for initiering av virkningspotensialer og har blitt grundig studert for deres molekylære struktur, montering og aktivitetsavhengig plastisitet. Giant ankyrin-G, hovedarrangøren av AIS, forbinder direkte med membran-spanning spenning gated natrium (VSVG) og kaliumkanaler (KCNQ2/3), samt 186 kDa neurofascin, en L1CAM celle vedheft molekyl. Giant ankyrin-G binder seg også til og rekrutterer cytoplasmatiske AIS-molekyler, inkludert beta-4-spectrin, og mikrotubulbindende proteiner, EB1/EB3 og Ndel1. Giant ankyrin-G er tilstrekkelig til å redde AIS-formasjon i ankyrin-G mangelfulle nevroner. Ankyrin-G inkluderer også en mindre 190 kDa isoform plassert ved dendritiske spines i stedet for AIS, som ikke er i stand til å målrette mot AIS eller redde AIS i ankyrin-G-mangelfulle nevroner. Her beskrev vi en protokoll ved hjelp av kultiverte hippocampale nevroner fra ANK3-E22/23-floxmus, som, når de ble transfektert med Cre-BFP, viser tap av all isoform av ankyrin-G og svekker dannelsen av AIS. Kombinert en modifisert Banker glia / neuron co-kultur system, utviklet vi en metode for å transfektere ankyrin-G null nevroner med en 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid, som er tilstrekkelig til å redde dannelsen av AIS. Vi bruker videre en kvantifiseringsmetode, utviklet av Salzer og kolleger for å håndtere variasjon i AIS-avstand fra nevroncellelegemene som forekommer i hippocampale nevronkulturer. Denne protokollen tillater kvantitative studier av de novo-samlingen og dynamisk oppførsel av AIS.
Introduction
Axon innledende segmentet er plassert på proksimal axon i de fleste virveldyr nevroner. Funksjonelt er AIS der handlingspotensialer igangsettes på grunn av den høye tettheten av spenningsporterte natriumkanaler i denne regionen. AIS av noen eksitatoriske nevroner er også målrettet av hemmende internuroner gjennom å danne GABAergic synapser1,2,3. Derfor er AIS et kritisk sted for å integrere cellesignalering og modulere eksitabiliteten til nevroner. AIS er normalt 20-60 μm i lengde og ligger innenfor 20 μm av cellekroppen. Lengden og posisjonen til AIS varierer i nevroner på tvers av hjerneregioner, så vel som i forskjellige utviklingsstadier av samme nevron4,5. Akkumulerte bevis antydet at sammensetningen og posisjonen til AIS er dynamiske i å svare på endringen av nevronaktivitet4,5,6,7.
480 kDa ankyrin-G er hovedarrangør av AIS. 480 kDa ankyrin-G er et membran assosiert adapterprotein som direkte binder seg til spenningsportede natriumkanaler samt andre store AIS-proteiner, inkludert beta4-spektrin, KCNQ2/3 kanaler som modulerer natriumkanalaktivitet8,9og 186 kDa neurofascin, en L1CAM som leder GABAergic synapses til AIS2,10. 480 kDa ankyrin-G deler kanoniske ankyrindomener som finnes i den korte 190 kDa ankyrin-G isoform (ANK repetisjoner, spectrin binding domene, regulatorisk domene), men er preget av en gigantisk exon som bare finnes i vertebrater og er spesielt uttrykt i nevroner (Figur 1A)11,12. Det 480 kDa ankyrin-G nevronspesifikke domenet (NSD) er nødvendig forAIS-formasjon 12. 190 kDa ankyrin-G fremmer ikke AIS-montering eller mål-AIS i ankyrin-G-null nevroner12. Imidlertid er 190 kDa ankyrin-G konsentrert ved AIS som inneholder 480 kDa ankyrin-G12. Denne evnen til 190 kDa ankyrin-G til å målrette forhåndsmontert AIS av wildtype nevroner har vært en kilde til forvirring i litteraturen og har bremset verdsettelsen av de kritiske spesialiserte funksjonene til 480 kDa ankyrin-G i AIS-forsamlingen. Derfor er det viktig å studere AIS-montering i ankyrin-G-null nevroner som mangler en forhåndsmontert AIS.
Her presenterer vi en metode for å studere monteringen og strukturen til AIS ved hjelp av dyrkede hippocampale nevroner fra ANK3-E22/23-floxmus som eliminerer alle isoformer av ankyrin-G13 (Figur 1B). Ved å transfektere nevroner med en Cre-BFP-konstruksjon før AIS er montert, genererte vi ankyrin-G-mangelfulle nevroner som helt manglet en AIS (Figur 1B, Figur 2). Monteringen av AIS er fullt reddet etter co-transfection av 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid med en Cre-BFP plasmid. Med denne metoden kan du studere AIS-samlingen i et ikke-forhåndsmontert AIS-miljø. Vi modifiserte også glia-neuron co-kultursystemet fra Gary Banker uten å bruke antibiotika, tidligere designet for embryonale dag 18 nevroner, for søknad om postnatal mus nevroner og tilpasset en AIS-kvantitetsmetode for å gjennomsnittlige AIS-målinger fra flere nevroner for å normalisere variasjonen av AIS14,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Samlingen av AIS er organisert av 480 kDa ankyrin-G. Ankyrin-G har imidlertid kortere isoformer som kan rette seg mot AIS av wildtype-nevroner, noe som kan føre til vanskeligheter med tolkning av strukturfunksjonsanalyser av AIS-montering. Her presenterer vi en metode ved hjelp av nevroner fra ANK3-E22/23-flox mus som tillater studie av de novo montering av AIS. Ved å transfektere med Cre-BFP ved 3 div, eliminerer vi alle endogene isoformer av ankyrin-G. Vi kunne også co-transfekt 480 kDa ankyrin-G f…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Gary Banker for forslag om nevronkulturprotokoll. Dette arbeidet støttes av Howard Hughes Medical Institute, et stipend fra NIH, og et George Barth Geller-begavet professorat (V.B.).
Materials
| 10xHBSS | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 18mm coverglass (1.5D) | Fisher Scientific | 12-545-84-1D | |
| 190kDa ankyrin-G-GFP | Addgene | #31059 | |
| 2.5% Tripsin without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 480kDa ankyrin-G-GFP | lab made | Provide upon request | |
| ANK3-E22/23f/f mice | JAX | Stock No: 029797 | B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J; |
| B27 serum-free supplement | Thermo Fisher Scientific | A3582801 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cell strainer with 70-mm mesh | BD Biosciences | 352350 | |
| Ceramic coverslip-staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Cre-BFP | Addgene | #128174 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995073 | |
| GlutaMAX-I supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668030 | |
| MEM with Earle’s salts and L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
| Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Poly-L-lysine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 26124-78-7 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 |
Riferimenti
- Nelson, A. D., et al. Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP. Molecular Psychiatry. , (2019).
- Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).
- Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM. Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).
- Hofflin, F., et al. Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332 (2017).
- Schluter, A., et al. Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development. Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).
- Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment. Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).
- Grubb, M. S., Burrone, J. Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability. Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).
- Pan, Z., et al. A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).
- Cooper, E. C. Made for “anchorin”: Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).
- Zhou, D., et al. AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing. The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).
- Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier. Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).
- Jenkins, P. M., et al. Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).
- Jenkins, P. M., et al. E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin. Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocol. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Berger, S. L., et al. Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment. Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).
- Yang, R., et al. Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).
