In vitro og in vivo levering av magnetisk nanopartikkelhypertermi ved hjelp av et spesialbygd leveringssystem

Summary

Denne protokollen presenterer teknikker og metodikk som er nødvendige for nøyaktig levering av magnetisk nanopartikkel hypertermi ved hjelp av et sofistikert leverings- og overvåkingssystem.

Abstract

Hypertermi har lenge vært brukt til behandling av kreft. Teknikkene har variert fra intratumoral innsetting av varme jernstenger, til systemisk leverte tumorantistoffmålrettede magnetiske nanopartikler, ved temperaturer fra 39 °C (febernivå) til 1000 °C (elektrokauteri) og behandlingstider fra sekunder til timer. Temperaturtidsforholdet (termisk dose) dikterer effekten med høye termiske doser som resulterer i vevsablasjon og lavere termiske doser som resulterer i subletale effekter som økt blodgass, akkumulering av legemidler og immunstimulering. En av de mest lovende nåværende medisinske terapiene er magnetisk nanopartikkelhypertermi (mNPH). Denne teknikken innebærer aktivering av magnetiske nanopartikler, som kan leveres systemisk eller intratumoralt, med et ikke-invasivt, giftfritt vekslende magnetfelt. Størrelsen, konstruksjonen og assosiasjonen av de magnetiske nanopartiklene og frekvensen og feltstyrken til magnetfeltet er viktige oppvarmingsdeterminanter. Vi har utviklet avansert instrumentering og teknikker for å levere reproduserbar magnetisk nanopartikkelhypertermi i store og små dyremodeller og dyrkede celler. Denne tilnærmingen, ved hjelp av kontinuerlig temperaturovervåking i sanntid på flere steder, gjør det mulig å levere veldefinerte termiske doser til målvevet (svulsten) eller cellene, samtidig som ikke-målvevsoppvarming begrenses. Nøyaktig kontroll og overvåking av temperatur på flere steder, og bruk av industristandardalgoritmen (kumulative ekvivalente minutter ved 43 °C / CEM43), muliggjør nøyaktig bestemmelse og kvantifisering av termisk dose. Vårt system, som tillater et bredt spekter av temperaturer, termiske doser og biologiske effekter, ble utviklet gjennom en kombinasjon av kommersielle oppkjøp og intern ingeniør- og biologiutvikling. Dette systemet er optimalisert på en måte som muliggjør rask konvertering mellom ex vivo, in vitro og in vivo teknikker. Målet med denne protokollen er å demonstrere hvordan man designer, utvikler og implementerer en effektiv teknikk og system for å levere reproduserbar og nøyaktig magnetisk nanopartikkelterapi (mNP) hypertermi.

Introduction

Hypertermi har historisk blitt brukt i kreftbehandling, enten alene eller i kombinasjon med andre behandlinger. Selv om den har en lang historie med bruk, diskuteres den mest fordelaktige metoden for å levere denne behandlingen fortsatt og er avhengig av sykdomssted og plassering. Metoder for hypertermi levering inkluderer mikrobølgeovn, radiofrekvens, fokusert ultralyd, laser og metalliske nanopartikler (som gull eller jernoksid) 1,2,3,4. Disse leveringsmetodene kan føre til en rekke behandlingstemperaturer fra febernivå til hundrevis av grader C. Den biologiske effekten av hypertermi avhenger hovedsakelig av temperaturene som brukes og varigheten^{av behandlingen.} For dette manuskriptet og formålet fokuserer vi på magnetisk nanopartikkelhypertermi (mNPH). Denne metoden tillater fokuserte, lokaliserte, godt overvåkede og kontrollerte temperaturendringer, ved bruk av giftfri, FDA-godkjent, jernoksid nanopartikler.

En fallgruve for andre hypertermimodaliteter er mangel på presis cellulær målretting; hypertermi har ikke et iboende høyt terapeutisk forhold, derfor er forsiktig termometri og målretting nødvendig⁶. mNPH tillater systemisk eller intratumoral injeksjon av mNPs, med varme som bare genereres der mNPene er lokalisert, og dermed målretter behandlingen direkte mot svulsten. mNPH kan være effektiv når de magnetiske nanopartiklene befinner seg i eller utenfor cellen. For kreftbehandling er den generelle oversikten over mNPH at de magnetiske nanopartiklene injiseres (intratumoralt eller intravenøst), deretter påføres et vekslende magnetfelt, noe som fører til at nanopartikkelens magnetiske poler hele tiden justeres, noe som fører til en lokalisert oppvarming av celler og vev assosiert med nanopartiklene ^7,8 . Ved å justere volumet av nanopartikler og frekvensen / styrken til det vekslende magnetfeltet (AMF), er det mulig å nøye kontrollere temperaturen som genereres i vevet.

Denne behandlingen fungerer bra i svulster som er nær kroppsoverflaten, da dypere svulster krever sterkere AMF, slik at risikoen for virvelstrømoppvarming øker⁹. Det er tegn på at hypertermi brukes klinisk som monoterapi, men ofte kombineres hypertermi med strålebehandling eller kjemoterapi, noe som fører til en mer målrettet anti-kreft effekt^10,11,12. Klinisk evidens for hypertermi i kombinasjon med strålebehandling er gjennomgått i en tidligere publikasjon¹³. Vårt laboratorium har vellykket behandlet en rekke dyr, fra mus til griser og spontane hundekreft, ved hjelp av mNPH-metoden^12,14,15. Denne protokollen er designet for de som er interessert i å undersøke effekten av lokalisert hypertermibehandling, enten alene eller i kombinasjon med andre terapier.

En av de viktigste faktorene i hypertermi er å kunne måle og forstå, i sanntid, den termiske dosen som leveres til målet / tumorvevet. En standard måte å beregne og sammenligne dose på er gjennom demonstrasjon av de kumulative ekvivalente minuttene med oppvarming ved 43 °C; Denne algoritmen gjør det mulig å sammenligne doser uavhengig av leveringssystemet, maksimums- og minimumstemperaturer (innenfor et bestemt område) og oppvarmings- / nedkjølingsparametere ^5,16. CEM-beregningen fungerer best for temperaturer mellom 39-57 °C⁵. For eksempel, i noen av studiene vi har utført, har vi valgt en termisk dose på CEM43 30 (dvs. 30 min ved 43 ° C). Ved å velge denne dosen kunne vi se på sikre, effektive immunogenetiske effekter in vitro, både alene og i kombinasjon med en enkelt stråledose¹⁷.

Med magnetisk nanopartikkel hypertermi er det flere faktorer som må vurderes ved bygging av et passende leveringssystem. Instrumenteringsdesignet inkluderer viktige sikkerhetsfaktorer, for eksempel bruk av en kjøler for å sikre at magnetfeltleveringsutstyret forblir kjølig selv når det drives med høy effekt, og feilsikre prosedyrer som forhindrer at systemet slås på hvis alle temperatur-, strømvurderings- og kontrollsystemer ikke er aktivert. I tillegg er det viktige biologiske faktorer som må vurderes for både in vivo og in vitro situasjoner. Ved bruk av dyrkede celler er det nødvendig å behandle i vekstmedier og opprettholde en konsistent levedyktig temperatur for å unngå fysiologiske endringer som kan påvirke resultatene. For individuelle nanopartikkeltyper er det viktig å kjenne den spesifikke absorpsjonshastigheten (SAR) ved beregning av AMF-baserte oppvarmingsparametere. På samme måte er det viktig å kjenne mNP/Fe-konsentrasjonen, i celler og vev, som er nødvendig for å oppnå ønsket oppvarming. In vivo-metoder krever enda mer oppmerksomhet på detaljer siden dyret må opprettholdes under anestesi under behandlingen og dyrets kjernekroppstemperatur opprettholdes på et normalt nivå gjennom hele behandlingen. Å tillate dyrets kroppstemperatur å falle, som skjer under anestesi, kan påvirke de samlede resultatene, med hensyn til den termiske dosen av vevet som behandles.

I dette manuskriptet diskuterer vi metodene som brukes til å designe og konstruere et allsidig magnetisk nanopartikkelhypertermisystem, samt viktige bruksfaktorer som må vurderes. Det beskrevne systemet muliggjør robust, konsistent, biologisk hensiktsmessig, sikker og godt kontrollert levering av magnetisk nanopartikkelhypertermi. Til slutt skal det bemerkes at mNPH-studiene vi utfører ofte involverer andre terapier som stråling, kjemoterapi og immunterapi. For at disse resultatene skal være meningsfulle, er det viktig å bestemme hvordan den leverte varmen kan påvirke effekten og / eller sikkerhetstoksisiteten til andre modaliteter (eller omvendt) og dyrets velvære. Av denne grunn og dosimetri og terapeutiske situasjoner som tidligere er nevnt, er det viktig å være oppmerksom på den magnetiske nanopartikkel hypertermi doseringsnøyaktighet og kontinuerlige kjerne- og måltemperaturmålinger. Målet med denne protokollen er å gi en enkel, konsistent metode og beskrivelse for levering av sikker og effektiv magnetisk nanopartikkel hypertermi.

Protocol

Dartmouth College Animal Care and Use Program er akkreditert av American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care (iAAALAC) og overholder alle UDSA og NIH (Office of Laboratory Animal Welfare) retningslinjer og forskrifter. Alle in vivo-studier ble godkjent av Dartmouth College Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Eutanasi-prosedyren overholder AVMA-retningslinjene for eutanasi av dyr fra 2020. 1. Instrumentering/design av systemet Design tilpa…

Representative Results

In vitro studierCeller vil bare oppnå og opprettholde ønsket temperatur og termisk dose hvis mengden og konsentrasjonen av magnetiske nanopartikler / jern og AMF er riktig tilpasset. Ved bruk av magnetiske nanopartikler til å varme celler in vitro (og in vivo), bør det bemerkes at for å oppnå hypertermi i celler med internaliserte magnetiske nanopartikler, vil et bestemt nivå av intracellulær mNP / Fe være nødvendig, og antall og nærhet av mNP-lastede celler, til hverandre, vil være nødv…

Discussion

Utformingen og implementeringen av dette systemet gir muligheten til å utføre nøyaktige og reproduserbare in vitro og in vivo magnetiske nanopartikkel hypertermi eksperimenter. Det er kritisk at systemet er utformet slik at AMF-frekvensen og feltstyrken er tilstrekkelig tilpasset den magnetiske nanopartikkeltypen, konsentrasjonen og vevsplasseringen og temperaturen som ønskes. I tillegg er nøyaktig overvåking av temperaturen i sanntid avgjørende for sikkerhet og beregning av en nøyaktig termisk dose (kumulative e…

Materials

.25% Trypsin	Corning	45000-664	available from many companies
1.5 mL tubes	Eppendorf	Eppendorf 22363204	available from many companies
B16F10 murine melanoma cells	American Type Culture Collection	CRL-6475
C57/Bl6 mice	Charles river	027C57BL/6	6-week-old female mice
Chiller	Thermal Care	NQ 5 series	chiller that cools the coil
Coolant fluid	Dow Chemical Company	Dowtherm SR-1	antenna cooling fluid
Fetal Bovine serum	Hyclone	SH30071	available from many companies
fiber optic probes, software and chassis	FISO		FISO evolution software used to read the temperatures
IR camera	Flir		infrared camera to monitor unintentional heating
iron oxide nanoparticles	micromod Partikeltechnologie GmbH	Bionized NanoFerrite	dextran coated iron oxide nanoparticles
mouse coil, solenoid	Fluxtrol	custom built
penicillin/streptomycin	Corning	45000-652	available from many companies
RF generator	Huttinger	TIG 10/300	power source
RPMI media	Corning	45000-396	available from many companies