Microscopia confocale e a forza atomica (Conpokal) quasi simultanea su cellule vive

Summary

Qui è presentato il protocollo della tecnica Conpokal, che combina microscopia a forza confocale e atomica in un'unica piattaforma di strumenti. Conpokal fornisce la stessa cellula, la stessa regione, vicino all'imaging confocale simultaneo e alla caratterizzazione meccanica di campioni biologici vivi.

Abstract

Le tecniche disponibili per la caratterizzazione meccanica su micro e nanoscala sono esplose negli ultimi decenni. Dall'ulteriore sviluppo del microscopio elettronico a scansione e trasmissione, all'invenzione della microscopia a forza atomica e ai progressi nell'imaging fluorescente, ci sono stati notevoli guadagni nelle tecnologie che consentono lo studio di piccoli materiali. Conpokal è un portmanteau che combina la microscopia confocale con la microscopia a forza atomica (AFM), dove una sonda "colpisce" la superficie. Sebbene ogni tecnica sia estremamente efficace per la raccolta di immagini qualitative e/o quantitative da sola, Conpokal fornisce la capacità di testare con imaging a fluorescenza miscelata e caratterizzazione meccanica. Progettato per l'imaging confocale quasi simultaneo e il sondaggio della forza atomica, Conpokal facilita la sperimentazione su campioni microbiologici vivi. L'intuizione aggiunta dalla strumentazione accoppiata fornisce la co-localizzazione delleproprietà meccaniche misurate (ad esempio,modulo elastico, adesione, rugosità superficiale) da parte di AFM con componenti subcellulari o attività osservabile tramite microscopia confocale. Questo lavoro fornisce un protocollo passo dopo passo per il funzionamento della microscopia a forza confocale e atomica a scansione laser, contemporaneamente, per ottenere la stessa cella, la stessa regione, l'imaging confocale e la caratterizzazione meccanica.

Introduction

Gli strumenti di valutazione meccanica su micro o nanoscala sono spesso utilizzati per scoprire le caratteristiche di deformazione a livello di singola cellula o microrganismo, mentre vengono utilizzati strumenti di microscopia ad alta risoluzione separati per visualizzare i processi subcellulari e le caratteristiche strutturali. Conpokal è la combinazione di microscopia confocale a scansione laser e microscopia a forza atomica (AFM) in un'unica piattaforma strumentale. La tecnica Conpokal fu implementata per la prima volta in un sistema polimerico non biologico, dove l'obiettivo era determinare l'adesione, l'elasticità e la tensione superficiale delle superfici dure a contatto con superfici morbide. Le immagini confocali fornivano un rendering visivo di come il polimero si deforma, aderisce e rilascia dalla sonda^{dura 1,2}. Dai polimeri ai campioni biologici, questa tecnica offre l'opportunità di imaging confocale a cellule vive o microrganismi quasi simultanei e AFM.

I cambiamenti nell'elasticità cellulare sono stati implicati nella patogenesi di molte malattie umane³ compresi i disturbi vascolari⁴Malaria^5,6, anemia falciforme⁷Artrite⁸Asma⁹, e il cancro^{6,10,11,12,13,14,15}. Tecniche comuni per misurare la meccanica delle cellule includono l'uso di perline magnetiche^16,17, pinzette ottiche^18,19, aspirazione micropipetta^8,20,21,22e AFM^{11,23,24,25,26}. Dall'applicazione dell'AFM alle cellule viventi, è stato prontamente adattato per caratterizzare la topografia cellulare^27,28 nonché le proprietà meccaniche^{11,24,29,30,31} con precisione su scala nanometrica. AFM è stato ulteriormente adattato per la microreologia^32,33, modulazione di frequenza^34,35, e strisciare^25,36,37 esperimenti per studiare le proprietà viscoelastiche di varie linee cellulari. L'uso di un modello di nanocontatto appropriato è fondamentale per l'estrazione di valori quantitativi di elasticità dalle misurazioni dell'indentazione della forza prodotte dall'AFM^1,2. Studi AFM che studiano l'influenza dei farmaci citoscheletrici sull'elasticità cellulare hanno dimostrato che il modulo elastico è altamente influenzato³⁸. Sulla base delle misurazioni del modulo elastico, molti ricercatori hanno dimostrato che le cellule cancerose sono più morbide delle loro controparti non trasformate^11,38,39. L'aumento della deformabilità gioca probabilmente un ruolo di primo piano nella capacità delle cellule tumorali di metastasi e infiltrarsi nei tessuti⁴⁰. Tale comportamento è regolato da modifiche nell'organizzazione citoscheletricha delle cellule^38,41,42. Oltre al cancro, un'altra classe di malattie meccanico-dipendenti sono le malattie respiratorie. Ad esempio, la sindrome da stress respiratorio acuto colpisce sempre più esseri umani ogni anno. È stato dimostrato che quando i pazienti vengono messi in ventilazione meccanica, con alte concentrazioni di ossigeno, le loro condizioni possono peggiorare⁴³. In una serie di studi che osservano macrofagi epiteliali alveolari con AFM, gli scienziati hanno scoperto che l'aggiunta di un ambiente ricco di ossigeno ha aumentato la rigidità delle cellule a causa della formazione di actina; un primo esempio dell'impatto che AFM ha sulla nostra comprensione dettagliata dell'influenza ambientale atmosferica sulla funzione respiratoria a livello cellulare e, in ultima analisi, sulla guarigione e la salute umana^44,45,46. La rigidità delle cellule epiteliali durante la migrazione verso una ferita può anche essere valutata tramite AFM e che si verifica una variazione nel modulo elastico per segnalare la diffusione futura delle cellule^47,48. Pertanto, c'è una necessità pratica di misurare quantitativamente la meccanica cellulare per capire come le cellule masticate differiscono da quelle sane e interagiscono con loro.

AFM viene utilizzato anche per studiare le proprietà adesive e la struttura della superficie. Un microscopio a forza atomica ha una varietà di modalità per raccogliere informazioni su un campione usando la meccanica di contatto. Per i campioni biologici viventi, due degli obiettivi primari sono ottenere valori quantitativi di proprietàmeccanica (ad esempio,moduli elastici, forze adesive) e mappare l'altezza della superficie. Queste modalità includono la modalità di maschiatura (nota anche come contatto intermittente), che mantiene una costante ampiezza a sbaloppo che contatta in modo intermittente la superficie del campione e la modalità di contatto, che solleva o abbassa il cantilever per mantenere una deflessione^{costante 49}. Le mappe di adesione possono essere raccolte utilizzando la mappatura della forza sul sistema AFM. Il cantilever indenta il campione a una certa forza e viene quindi ritirato. La forza che resiste alla retrazione viene misurata dal rivelatore per generare un grafico di spostamento della forza. La forza di adesione è la forza massima misurata durante la retrazione. La morfologia della superficie fornisce una visione dettagliata del campione a livello micro o nano. Il cantilever completa una scansione raster attraverso il campione in base all'indentazione e alla deflessione catturate dal movimento del sbalzino ad ogni pixel, rivelando caratteristiche di dimensioni micro e nanometriche. Con AFM, è possibile misurare le dimensioni di piccole caratteristiche come la struttura peptidoglycan^50,l'allineamento^{della catena polimerica 51,}la flagella^52,lamellipodia⁵³e la filipodia^54. Mentre la potenza di AFM risiede nelle curve di spostamento della forza e nelle immagini topologiche non ottiche, la microscopia confocale offre immagini dettagliate di campioni etichettati fluorescentmente.

La microscopia a scansione laser confocale (CLSM) è una tecnica dominante per l'imaging di cellule vive, cellule fisse e tessuti^55,56,57. Clsm è stato impiegato per l'imaging biologico dal 1955, cioè,sin dalla sua nascita^58,59. Mentre il principio di funzionamento dei microscopi confocali ( cioè , il rifiuto della luce fuori fuoco attraverso un foro stenopeica) è rimasto in gran partelo stesso, l'implementazionetecnica è^{diventata molto diversificata 56,57,58,60}. L'imaging confocale può essere implementato tramite scansione multipunto, come in un sistema di dischi^{rotanti 61,}scansione puntiforme di un singolo raggio laser, come nella scansione in^{linea 62,}o imaging della funzione di diffusione del punto con successive riassegnazioni di pixel tramite un rilevatore multi-elemento⁵⁷. Recenti progressi che espandono l'utilità dell'imaging confocale includono capacità di scansione laser, scansione di risonanza ad alta velocità e rivelatori^{ad alta sensibilità 63,64,65}. Il vantaggio che tutti i sistemi confocali hanno sui microscopi a campo largo è la capacità di eseguire sesszioni ottiche nell'asse z con maggiori dettagli, specialmente in campioni spessi. I microscopi widefield che utilizzano il rilevamento basato su telecamera raccolgono la luce emessa dal piano focale e, contemporaneamente, la luce emessa da tutto il percorso di illuminazione. Chiudendo il foro stenopeica, a costo di ridurre il segnale, sia la risoluzione assiale che laterale possono essere aumentate^{di 66}. In CLSM, le immagini vengono costruite pixel per pixel attraverso la raccolta del segnale di emissione mentre un laser di eccitazione viene scansionato su un campo visivo x-y. La raccolta di diversi piani x-y lungo l'asse z del campione può quindi essere utilizzata per ricostruire l'architettura tridimensionale^{del campione 57,67}. La microscopia confocale in concomitanza con l'introduzione di proteine fluorescenti, ha rivoluzionato la nostra comprensione della biologia^{cellulare 68}. Ad esempio, è diventato uno strumento essenziale nelle neuroscienze⁶⁹. Il CLSM viene regolarmente utilizzato per osservare i tessuti cancellati e per ottenere immagini complete dell'architettura del cervello e della rete neuronale macchiata^{immunitaria 70}. Questa applicazione ha portato a nuove intuizioni sui contatti sinaptici e sulla comunicazione tra neuroni e cellule gliali nel cervello⁷¹. Dalle cellule cerebrali alle vescicole, i protocolli di colorazione fluorescente supportano l'ispezione e la cattura delle funzioni cellulari tramite microscopia confocale per i progressi nelle tecniche^{terapeutiche 72,73}.

Sebbene siano strumenti impressionanti e versatili individualmente, la combinazione di microscopia a forza confocale e atomica (Conpokal) consente ai ricercatori di correlare in modo univoco le proprietà topografiche e micromeccaniche cellulare/tissutale con l'osservazione di vari organelli cellulari e le rispettive dinamiche. La strumentazione accoppiata consente agli utenti, essenzialmente, di "vedere" cosa stanno sondando; un enorme vantaggio rispetto a una tecnica da sola. Con Conpokal, la mappatura della forza attraverso l'AFM è sovrapposta alle immagini confocali per correlare la rigidità cellulare, l'adesione o la morfologia alla struttura citoscheletricha all'interno del campione, per esempio. L'obiettivo generale del metodo Conpokal è quello di fornire una piattaforma per i ricercatori per studiare campioni viventi in modo conciso ed efficace, fornendo dati di proprietà di immagini e materiali in un'unica piattaforma. In questo lavoro, dimostriamo il funzionamento di Conpokal, tra cui una corretta selezione e preparazione del campione, la configurazione dello strumento, la calibrazione a sbalzi e forniamo linee guida per una risoluzione dei problemi riuscita. Dopo il protocollo, forniamo risultati rappresentativi che includono la mappatura dell'altezza AFM di batteri e cellule di successo, la mappatura del modulo AFM batterico e cellulare e l'imaging confocale di cellule multietichettate, attraverso confocale e AFM a stesse cellule. Concludiamo con una discussione sui passaggi critici della procedura Conpokal, sulle raccomandazioni per la risoluzione dei problemi, sulle limitazioni tecniche, sul significato e sulle prospettive future del metodo.

Protocol

1. Preparazione di strumenti, mezzi di cultura, piatti

1. Accendere le fonti di energia sia per il microscopio confocale che per il microscopio a forza atomica, così come per qualsiasi altro strumenti o dispositivo associato utilizzato durante Conpokal. Concedi tempo sufficiente affinché gli strumenti equilibrano e stabilizzino termicamente prima di iniziare le misurazioni. In genere, 1 h è sufficiente.
2. Preparare una piastra di Petri pulita, approvata dal sistema, con fondo di vetro e riempire metà piena, ma non più di due terzi piena, con salina tamponata di fosfato (PBS) o liquido trasparente simile. Questo piatto (indicato come "piatto di calibrazione") è separato dalle stoviglie campione e verrà utilizzato per localizzare e calibrare il cantilever del microscopio a forza atomica (AFM).
   NOTA: È importante che il liquido sia limpido e abbia una bassa autofluorescenza per prevenire qualsiasi interferenza con gli spettri di fluorescenza. Il PBS è raccomandato perché imita l'ambiente biologico.
3. Preparare piatti sperimentali in modo che il liquido associato abbia riempito il piatto almeno mezzo pieno. Se il campione è fluorescente, assicurarsi che sia coperto o in un luogo buio fino a quando necessario. Pulire il fondo di tutte le stoviglie in vetro utilizzando detergente per lenti e salviette per lenti.
4. Creare cartelle di archiviazione dati per il confocale e l'AFM nei dischi rigidi dei computer.

2. Selezione di cellule o microrganismi

1. Per creare una soluzione di stock batterico, inoculare i batteri Streptococcus mutans, utilizzando un circuito di inoculazione, in 15 mL di lievito Todd Hewitt (THY) durante la notte (per fase esponenziale) in un incubatore di CO_{2 al 5%.}
2. 1 h prima che l'incubazione notturna sia completa, rivestire piatti sperimentali campione con 1 mL di soluzione di poli-l-lisina o abbastanza per coprire la porzione di vetro del piatto con fondo di vetro e lasciare nell'armadio di biosicurezza per 1 h. Dopo l'impostazione, aspirare la soluzione di poli-l-lisina e risciacquare i piatti 3 volte con PBS.
3. Dopo 18 - 24 ore di incubazione batterica, inoculare THY con 1 mL di sospensione batterica fino a raggiungere una densità ottica di 0,6 - 0,7 (i valori tipici per l'inoculazione sono 3 mL di THY con 1 mL di sospensione batterica per piatto). Aggiungere 1 mL di nuova soluzione batteriche a ogni piatto rivestito di poli-l-lisina e incubare per 1 h. Durante gli ultimi 10 minuti, aggiungere 1 mL di macchia di membrana fluorescente verde (concentrazione di 1 μM) a ogni piatto.
4. Risciacquare ogni piatto 3x con PBS. Fissare delicatamente i batteri con circa 1 mL di soluzione di paraformaldeide al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente all'interno di un armadio di biosicurezza. Risciacquare ogni piatto 3 volte con PBS dopo la fissazione.
5. Conservare il rene embrionale umano (HEK) 293 cellule in azoto liquido. Eseguire lo scongelamento rapido a 37 °C bagno d'acqua prima della placcatura.
6. Aggiungere 1 mL di soluzione di matrice di membrana basale nei mezzi di coltura cellulare a ogni piatto del campione cellulare e incubare (5% CO₂₎a 37 °C per 1 h. Aspirare la soluzione e lavare i piatti con mezzi di coltura cellulare. Placcare il numero richiesto di cellule HEK 293(ad esempio,100.000 celle per piatto da 35 mm) e aggiungere 2 mL di mezzi di coltura cellulare. Quindi incubare (5% CO₂₎le cellule a 37 °C per 48 ore.
7. Dopo 48 ore, aggiungere 2 μL di un colorante citoscheletro microtubulo fluorescente (concentrazione di 1x) a ogni piatto campione cellulare e incubare per 30 minuti. Aspirare la soluzione contenente il colorante, lavare le celle 3 volte con PBS e aggiungere 2 mL di mezzi di coltura cellulare.
8. Aggiungere 1 μL di colorante a membrana plasmatica (concentrazione di 10 μM) ai piatti campione e incubare per 30 minuti. Lavare la soluzione contenente il colorante 3x con PBS e aggiungere 2 mL di mezzi di coltura cellulare.
9. Controsostenere il nucleo aggiungendo 1 μL di una soluzione di colorante acido nucleico (concentrazione di 10 μM) alle stoviglie campione e incubare per 30 minuti. Lavare la soluzione contenente il colorante 3x con PBS e aggiungere 2 mL di mezzi di coltura.

3. Procedura AFM

1. Aprire il software operativo AFM (Atomic Force Microscope) facendo clic sull'icona del software sul computer.
2. Ruotare o inserire un obiettivo dell'aria a basso ingrandimento (consigliato 10x o 20x). Una lunga distanza di lavoro di 5 mm o più è utile durante l'abbassamento e la calibrazione della punta.
3. Montare la fase di esempio di cella scelta se non è già installata. Per i campioni vivi, utilizzare un riscaldatore per piatti per mantenere il campione alla temperatura desiderata.
4. Caricare la piastra di Petri pulita e approvata dal sistema riempita mezzo pieno di PBS (preparato nel passaggio 1.2) o liquido trasparente simile (piastra di calibrazione). Se lo stadio del campione ha fermagli integrati, utilizzare questi, altrimenti, utilizzare il grasso sottovuoto per stabilizzare il campione.
5. Selezionare un cantilever AFM appropriato per la raccolta dei dati desiderata e installarlo seguendo i passaggi seguenti.
   1. Utilizzando i guanti, montare il chip AFM nel blocco di vetro utilizzando lo stadio di montaggio del chip AFM, le pinzette e un piccolo cacciavite. Posizionare con cura il chip AFM sul blocco di vetro e orientarlo in modo che sia centrato. Il sbalzino, più una porzione molto piccola del chip AFM, dovrebbe essere nella porzione visibile e non opaca del blocco di montaggio.
   2. Fissare il chip con il cacciavite stringendo la vite fino a quando il chip non è aderente contro il blocco di vetro. Verificare che il cantilever AFM sia orientato correttamente utilizzando un microscopio stereo o un cannocchiale portatile. Regolare in base alle esigenze. Una volta orientato correttamente, posizionare il blocco di vetro nella testa AFM nell'orientamento corretto e bloccarlo in posizione.
      NOTA: L'orientamento del chip AFM all'interno del blocco di vetro è importante in modo che i laser di sistema puntino sul retro del cantilever e riflettano correttamente sul fotorivelante. Fare attenzione a non mettere troppo a tenuta stagna le viti durante il posizionamento in quanto questa procedura potrebbe causare la rottura del chip AFM, della sbalza o della punta.
6. Utilizzando l'opzione brightfield del microscopio confocale, individuare la parte inferiore della piastra di calibrazione utilizzando la manopola di messa a fuoco. Prendere nota di questa altezza z come valore in cui si trova il fondo del piatto rispetto all'obiettivo del microscopio.
7. Utilizzando il pannello di controllo del motore del sistema AFM sul computer che aziona i motori stepper z, spostare la sbalza AFM lontano dal campione verso l'alto di 2000 μm.
8. Utilizzando entrambe le mani, posizionare delicatamente la testa AFM con il chip AFM sullo stadio del campione assicurandosi che ciascuno dei punti verticali sulla testa AFM sia saldamente impostato nelle scanalature designate sullo stadio AFM. Una volta che la testa AFM è in posizione, vedere visivamente quanto è vicino il supporto a sbalzi al piatto. Se sembra essere troppo vicino, in modo che la testa AFM sia in contatto o entro 1 mm dalla parte superiore della piastra del campione, eseguire il back out utilizzando i motori stepper z prima di abbassare la punta AFM verso il campione.
9. Utilizzando l'illuminazione a campo luminoso, abbassare lentamente il chip AFM sul fondo della piastra di vetro utilizzando il pannello di controllo del motore stepper z sul software AFM. Individuare i micrometri manuali che controllano il movimento x-y o in piano della testa AFM sulla piattaforma dello strumento. Regolare la posizione del cantilever AFM all'interno del campo visivo correggendo la testa AFM man mano che il cantilever entra in vista.
   1. Poiché la posizione rispetto al fondo del piatto è sconosciuta al momento, inferiore con gradini di 100 - 200 μm per evitare di schiantare la punta AFM nella piastra di Petri. In genere, la punta deve essere abbassata di 800 - 2000 μm. Man mano che la punta viene abbassata, guarda un'ombra apparire sulla vista software del microscopio, il che indica che la punta AFM si sta avvicinando alla parte inferiore del piatto.
   2. Diminuire gli incrementi a 20 - 50 μm. Assicurarsi di regolare le tabelle di ricerca (LTT) dell'immagine della fotocamera man mano che la punta si abbassa nel piatto utilizzando il pannello LTT sul software confocale. Continuare ad abbassare la punta AFM utilizzando piccoli gradini fino a quando non è per lo più a fuoco.
   3. Assicurarsi che la punta sia abbastanza scura in modo che la forma generale di essa possa essere vista e centrata nel campo visivo. Assicurati anche che la punta appaia sfocata, il che conferma che non ha ancora incontrato il fondo del piatto.
10. Regolare la messa a fuoco del microscopio in modo che la punta sia ora a fuoco, tenendo presente la distanza di lavoro dell'obiettivo. Prima di passare a un obiettivo di ingrandimento più elevato, utilizzare lo strumento di misurazione del microscopio per raccogliere la larghezza e la lunghezza del cantilever AFM accedendo al pannello degli strumenti di misurazione sul software confocale. Prendere nota di queste misurazioni.
    NOTA: È importante non schiantare l'obiettivo sul fondo del piatto campione che può anche causare il contatto del piatto campione con la punta AFM, potenzialmente danneggiarlo.
11. Se presente, rimuovere il filtro della luce laser e assicurarsi che il laser AFM sia attivo, in modo che la luce laser diventi visibile nell'ottica.
    1. Utilizzando i quadranti di allineamento laser, spostare il laser nel campo visivo e vicino alla punta AFM. Una volta che il laser si trova in questa posizione, sostituire il filtro della luce laser.
    2. Utilizzando i quadranti di allineamento laser, posizionare il laser sul retro del punto in cui si trova la punta AFM sul sbalzino. A questo punto, il pannello di allineamento laser dovrebbe leggere un segnale di somma maggiore di 0,0 V. Se non viene ottenuto alcun segnale di somma, regolare lo specchio utilizzando la manopola dello specchio controllata manualmente fino a quando un segnale di somma maggiore di 0,0 V non legge sullo schermo.
    3. Spostare il laser in piccole quantità in tutte le direzioni sul cantilever AFM fino a raggiungere il segnale di somma massima, ma la posizione è alla punta AFM. Una volta impostata la posizione laser, azzerare la deflessione verticale e laterale utilizzando i quadranti di deflessione controllati manualmente.
    4. Osservare il pannello di allineamento laser sul software AFM e utilizzando le manopole di deflessione verticali e laterali sulla testa AFM, allineare il rilevatore in modo che il bersaglio sia centrato (punto rosso al centro del mirino) e non vi sia alcuna deflessione verticale o laterale.
12. Aprire la finestra di calibrazione nel software AFM. Inserire tutte le informazioni specifiche dell'esperimento. Prima di calibrare, spegnere la sorgente luminosa del microscopio confocale e chiudere l'involucro AFM, se applicabile, per smorzare qualsiasi potenziale rumore proveniente dalla luce della stanza o dalle vibrazioni della stanza. Quindi premere il pulsante di calibrazione per consentire automaticamente al sistema di calibrare la punta. Al termine della calibrazione, la rigidità della sbalza (N/m) e la sua sensibilità (nm/V) saranno fornite all'interno del pannello di calibrazione. Si noti che questi per analisi successive.
13. Ritrarre il sbalzino AFM di almeno 2000 μm con i motori stepper. Togliere la testa AFM dal palco e rimuovere la piastra di calibrazione. Ruotare o inserire l'obiettivo desiderato. Ritrarre l'obiettivo 10% della distanza di lavoro se il sistema è programmato per mantenere lo stesso piano focale tra gli obiettivi. Se questo è un obiettivo petrolifero, metti una goccia di olio ad immersione sull'occhio dell'obiettivo.
    NOTA: La retrazione dell'obiettivo riduce la probabilità che l'obiettivo contatti il piatto campione durante il posizionamento.
14. Per mantenere saldamente il piatto campione in posizione, utilizzare un batuffolo di cotone per applicare piccoli tamponi di grasso sottovuoto attorno al bordo dell'anello del campione all'interno dello stadio del campione o utilizzare clip campione. Caricare con cura il piatto campione nella fase del campione.
15. Una volta posizionato il campione, ruotarlo alcune volte per garantire una buona tenuta del piatto al portacampioni tramite il grasso. Alza l'obiettivo sul fondo del piatto fino a quando l'olio non si assorbe sopra l'occhio dell'obiettivo.
16. Utilizzando il microscopio, senza la testa AFM sul palco, mettere a fuoco il sistema di imaging in modo che il campione sia a fuoco. Si noti questa altezza z come riferimento.
17. Sostituire con cura la testa AFM sulla piattaforma.
18. Utilizzando i motori stepper z, abbassare la punta verso il campione. Man mano che la punta AFM viene abbassata, regolare le tabelle di ricerca (LUN) nell'immagine del campo luminoso in base alle esigenze. Abbassare la punta fino a quando non è quasi affilata. Utilizzando i micrometri di posizione della punta AFM azionati manualmente, spostare la testa AFM in modo che la punta AFM sia al centro o a sinistra centrata nel campo visivo.
    NOTA: Poiché l'altezza z dell'AFM è stata notata prima nel passaggio 3.6, possono essere prese misure più grandi per abbassare la punta AFM, tuttavia, il grasso è stato aggiunto al fondo del piatto e potenzialmente olio all'obiettivo, quindi questo valore è solo per riferimento. Si consiglia di fare passi da 50 a 100 μm e di regolarsi più piccoli man mano che la punta entra a fuoco
19. Riregolare la posizione del laser utilizzando i micrometri manuali sulla testa AFM. Se necessario, azzerare le deformazioni verticali e laterali regolando le rispettive manopole e ricalibrare la sbalziera AFM nella piastra del campione.
    NOTA: Se il cantilever è stato calibrato in un supporto diverso dal campione, deve essere ricalibrato nel mezzo di scansione per tenere conto di una potenziale variazione dell'indice di rifrazione. Inoltre, il laser può derivare dal retro della sbalziola a causa di rumori o variazioni di temperatura. Riregolare il laser e ricalibrare solo se necessario e nella piastra campione sopra il substrato di vetro se si utilizza la calibrazione senza contatto. Se si utilizza la calibrazione del contatto, ricalibrare all'interno della piastra di calibrazione utilizzando il mezzo campione.
20. Per ottenere immagini al microscopio confocale di alta qualità, sostituire l'attuale filtro luminoso attenuante con il filtro che blocca tutta la luce laser AFM. Questo filtro luminoso non garantisce alcuna interferenza dalla luce intensa del laser AFM.
21. Utilizzando il pulsante di comando di avvicinamento automatico, in genere indicato da una freccia rivolta verso il basso, abbassare la punta verso il fondo del piatto campione. Impostare le dimensioni/area della scansione, la risoluzione, il setpoint, la lunghezza z e il tempo in pixel (o utilizzare i valori calibrati/propagati) sul pannello di controllo dell'imaging e iniziare la scansione.
22. Al termine di una scansione, sollevare il chip AFM da 50 a 100 μm prima di passare a una nuova posizione di misurazione nella piastra del campione. Una volta trovata una nuova posizione, avvicinarsi al vetro e ricominciare a scansionare seguendo i passaggi 3.21 e 3.22.
23. Selezionare l'opzione Salvataggio automatico oppure salvare manualmente ogni file generato da ogni singola scansione facendo clic su Salva.

4. Procedura confocale

1. Aprire il software operativo confocale. Assicurarsi che tutte le periferiche, le sorgenti luminose e i controller associati siano accesi e funzionino normalmente.
2. Ruotare o inserire un obiettivo di ingrandimento basso (10x o 20x) per visualizzare l'esempio. Assicurarsi che l'obiettivo sia a una distanza di lavoro sicura da dove si trova il piatto campione e, se necessario, eseguire il back-out dell'obiettivo per evitare qualsiasi potenziale collisione dell'obiettivo con il campione. Utilizzando un batuffolo di cotone, tamponare il grasso sottovuoto attorno al bordo dell'anello del piatto campione. Se si utilizza un obiettivo di olio, posizionare una singola goccia di olio ad immersione sulla lente anteriore dell'obiettivo
3. Posizionare il campione desiderato nella fase del campione. Ruotare il campione circa alcune volte per assicurarsi che il grasso sottovuoto abbia generato un legame stretto con l'inserto dello stadio del campione o utilizzare clip campione. Se si utilizza un obiettivo di olio, aumentare l'obiettivo sul fondo del piatto in modo che l'olio si assorba sul fondo di vetro. Per evitare un eccessivo sbiancamento, ridurre al minimo l'illuminazione ambientale.
4. Utilizzando modalità brightfield o epifluorescenza tramite la fotocamera o gli oculari, individuare il campione e utilizzare la manopola di messa a fuoco, concentrarsi su un'area di interesse contenente più celle o una singola cella. Spesso, il campo visivo all'interno del microscopio ottico sarà più grande della finestra di scansione x-y sul sistema AFM (100 x 100 μm). Effettuare regolazioni della posizione AFM all'interno del campo visivo confocale utilizzando il pannello di controllo del motore nel software AFM in modo che la scansione AFM e l'ottica confocale immaginino le stesse caratteristiche.
   NOTA: All'interno del campo visivo, in genere ci sono solo poche celle, quindi è più facile determinare quale cella si desidera sondare. Man mano che AFM viene condotto, la cella diventa visibile sul software AFM e, da lì, l'utente può individuare specifiche regioni di interesse da sondare.
5. Se lo si desidera, acquisire immagini in campo luminoso o epifluorescenza utilizzando una fotocamera o modalità CLSM in base all'etichetta del campione, alle manopole di messa a fuoco e ai pulsanti di acquisizione sul software del microscopio.
6. Utilizzando il software del microscopio, selezionare l'opzione o aprire il pannello per abilitare le funzionalità confocali(ad esempio,laser e parametri successivi). Questa opzione è tipicamente notata dai valori di lunghezza d'onda della linea laser.
7. Selezionare le linee laser appropriate per i coloranti utilizzati per la colorazione dei campioni. Attivare una o più linee laser per eccitare e immagini tali funzionalità nell'esempio.
8. Impostare il guadagno su un valore che ottimizza la fluorescenza dei campioni ma limita la quantità di rumore. Un valore iniziale tipico è un guadagno di 70.
9. Regola la potenza del laser per evitare pixel saturi ma massimizzare l'intervallo dinamico. Un intervallo di partenza tipico per la potenza del laser è dall'1 al 3 %.
10. Impostare la dimensione del foro stenopeica su 1 unità Airy per massimizzare la risoluzione per il sessatura ottica. Se il campione è fioca e la potenza del laser è già alta, aprire il foro stenopeica per aumentare il segnale a costo di diminuire la risoluzione dell'asse z.
11. Impostare il tempo di divadelpixel (ad esempio, la velocità di scansione). Iniziare con un tempo di dimora di 2 μs e, se necessario, regolare per riflettere la luminosità del campione. Scegli la dimensione/dimensione di scansione dei pixel per l'obiettivo selezionato lasciando che lo strumento lo calcoli tramite il pulsante di opzione Nyquist e il numero scelto di pixel nell'immagine.
    NOTA: Tempi di soffermazione più lunghi in campioni più spessi possono portare a uno sbiancamento eccessivo quando vengono raccolte pile z.
12. Selezionare l'opzione Scansione sul software dello strumento e iniziare la raccolta dei dati.
    NOTA: Se lo strumento ha più laser, ognuno può essere ottimizzato in modo indipendente e quindi eseguito contemporaneamente per immagini multi-fluorescenti.
13. Utilizzare la manopola di messa a fuoco per ingrandire e ridurre e individuare il campo visivo ottimale nel campione.
14. Acquisire immagini utilizzando il pulsante Capture del sistema e salvare tutti i formati di file necessari dell'esempio in una posizione/cartella desiderata sul disco rigido del computer o sul disco rigido esterno locale.
15. Continua a regolare di conseguenza guadagno, potenza laser, dimensioni del foro stenopeica, frequenza di campionamento e altri valori per ottimizzare l'immagine. L'indice di saturazione dei pixel può essere attivato per verificare se i pixel sono sovrasaturi. Se questa sovrasaturazione è presente, il guadagno e la potenza del laser possono essere riadattati per eliminare i pixel saturi. Utilizzare i LUN come guida per apportare regolazioni specifiche.
16. Se possibile, utilizzare la frequenza di campionamento nyquist del sistema, che viene visualizzata nel software come pannello o pulsante, per garantire che le immagini vengano raccolte alla massima risoluzione ottenibile.
17. Attiva lo stack z del sistema confocale o lo strumento di raccolta del volume dell'immagine. Utilizzando un'opzione dal basso verso l'alto, con una sola linea laser, in particolare la linea laser che illumina una feature nel campione più chiara, impostare i piani di inizio e fine per il volume da misurare.
18. Usa la spaziatura suggerita tra i piani nella pila z, che viene calcolata per soddisfare i criteri di campionamento nyquist per la migliore risoluzione assiale ottenibile offerta dallo strumento e dalla linea laser utilizzata.
19. Quando vengono utilizzate più linee laser, utilizzare la lunghezza d'onda più corta per il calcolo della spaziatura. Al termine dell'acquisizione, salvare il file nella cartella appropriata.
20. In alternativa, se esiste una conoscenza a priori dello spessore del campione, definire il volume selezionando il piano intermedio, quello che appare il più luminoso e nitido. In questa situazione, impostate la parte superiore a metà dello spessore del campione sopra il piano centrale e il fondo a metà dello spessore al di sotto del piano centrale.
21. Al termine della raccolta dei campioni in questo campo visivo o dopo che il campione è stato sbiancato, utilizzare la fase motorizzata o controllata manualmente per trovare un altro luogo di interesse sul campione e ripetere i passaggi per la raccolta delle immagini.

5. Procedura di pulizia

1. Assicurarsi che tutti i file di dati, sia del CLSM che dell'AFM, vengano salvati nelle posizioni corrette.
2. Ritrarre il chip AFM utilizzando i motori stepper z almeno 2000 μm o la distanza percorsa per raggiungere la superficie del campione. Rimuovere la testa AFM dal palco e posizionarla con cura nel suo luogo di riposo.
3. Ritrarre l'obiettivo del microscopio in modo che sia lontano dal campione. Se è stato utilizzato un obiettivo di olio, l'obiettivo dovrebbe essere ritirato abbastanza lontano da non esserci più alcun contatto tra l'obiettivo e il substrato del campione.
4. Utilizzando guanti, rimuovere il campione e pulire il grasso e, se del caso, l'olio dal fondo del piatto campione. Acquisire una nuova piastra di Petri pulita e vuota e riempirla con una soluzione di etanolo del 70% piena da metà a tre quarti. Posizionarlo nel portacampioni e sostituire la testa AFM per consentire al chip AFM di immergersi nella soluzione di etanolo per 5 minuti.
5. Mentre il chip AFM è in ammollo, si consiglia di iniziare a copiare i dati dell'esperimento su un disco rigido esterno. Dopo l'immersione del chip AFM in soluzione di etanolo per almeno 5 minuti, rimuovere la testa AFM e metterla nel suo luogo di riposo.
6. Utilizzando i guanti, rimuovere il supporto del chip AFM e posizionarlo nella stazione di montaggio. Rimuovere con cura il chip AFM utilizzando una pinzetta con impugnature in gomma. Posizionare di nuovo la punta usata nella posizione della scatola da cui proviene orientata fuori asse per indicare che è stata utilizzata. Per riferimento futuro, si noti quale suggerimento è stato utilizzato nell'esperimento.
7. Togliere la piastra di Petri riempita con la soluzione di etanolo dal sistema e smaltire il liquido e la piastra. Utilizzando guanti, detergenti per lenti e salviette per lenti, pulire delicatamente l'olio dall'obiettivo del microscopio seguendo i protocolli standard. Pulire il portacampioni rimuovendo qualsiasi grasso. Smaltire tutti i materiali di scarto secondo protocolli di biosicurezza e restituire gli strumenti nelle loro sedi note.
8. Completare la raccolta dei dati dai computer e spegnerli. Spegnere tutti gli strumenti, gli accessori, le periferiche o altri dispositivi utilizzati per l'esperimento.

Results

La tecnica Conpokal è rappresentata schematicamente nella figura 1A e un'immagine dell'impostazione è illustrata nella figura 1B. Al fine di co-localizzare accuratamente le strutture biologiche tramite microscopia confocale con le stesse strutture in AFM, l'allineamento dei due sistemi durante l'installazione è fondamentale. Seleziona produttori confocali e AFM affidabili che hanno familiarità con i requisiti spaziali dell'altro. Inoltre, l'implementazione di successo della tecnica si basa su buone procedure di colorazione, immobilizzazione della struttura biologica e scelta appropriata della punta AFM. L'altezza delle cellule viventi rappresenta spesso una sfida per l'imaging AFM. Una scansione AFM su una cella HEK vivente è illustrata nella figura 2A. L'altezza di questa particolare cella HEK era di circa 10 μm, dimostrata dalla scansione della linea in verde (Figura 2B). Una punta AFM con offset zero (la punta è all'estremità del sbalzino) o l'altezza della punta maggioredell'altezza della cella (ad esempio, altezzadella punta ≥ 10 μm) produrrà un'immagine altamente risolta delle singole cellule. Nella figura 2C è incluso un esempio di scansione scadente a causa di una scelta impropria della punta AFM. In questa immagine, i pixel neri sono apparsi all'apice della cella indicando che il piezo AFM non è nel raggio d'azione a causa di una grande altezza della cella. L'estremità del cantilever AFM è apparsa nell'immagine (un quadrato arrotondato) a causa dell'offset della punta combinato con un'altezza insufficiente della punta rispetto all'altezza della cella. Questi artefatti nell'immagine AFM indicano che è necessario scegliere un suggerimento AFM diverso per l'immagine della cella.

Per questo metodo è necessaria un'etichettatura efficiente nella colorazione a fluorescenza insieme alla sonda corretta per l'imaging di cellule vive. Abbiamo eseguito un'immagine confocale a tre colori mostrata nella figura 3A con una macchia nucleare (blu fluorescente), una macchia di microtubuli (verde fluorescente) e una macchia di membrana lipofila (rosso fluorescente). Queste sonde a celle vive sono state scelte a causa della loro limitata sovrapposizione spettrale e della loro compatibilità con i cubi filtranti standard. Abbiamo anche incluso l'immagine ottica brightfield nella figura 3B.

Da AFM, l'analisi delle impronte delle punta insieme a un modello nanomeccanico, produce una mappa del modulo della superficie. Un esempio di mappa del modulo costruita utilizzando un adattamento del modello Hertz e un profilo parabolico (raggio di 8 nm) per la forma della punta viene mostrato sovrapposto alla ricostruzione 3D della forma della cella nella figura 4A (che è la stessa due celle mostrata nella figura 3). La corrispondente proiezione 3D della pila z confocale laser è illustrata nella figura 4B.

Il metodo è adatto anche per strutture biologiche più piccole, compresi singoli batteri le cui caratteristiche micro e nanoscopiche sono difficili da risolvere usando la microscopia ottica. Uno studio in corso utilizza la tecnica Conpokal per esplorare meccanismi meccanici all'interno della parete cellulare che influenzano la resistenza agli antibiotici nello Streptococcus mutans.⁷⁴ La manipolazione dei componenti della parete cellulare ha portato a cambiamenti nella morfologia e nella resistenza agli antibiotici. Conpokal facilita la raccolta di dati dal vivo, in soluzione (ad esempio, morfologiadella superficie, modulo elastico, resistenza all'adesione e rugosità superficiale) su campioni a celle uguali per accoppiare le proprietà meccaniche con la presenza o l'assenza di componenti della parete cellulare. La figura 5A,B include una scansione AFM e una mappa del modulo misurata di un batterio Streptococcus mutans. Una migliore risoluzione è stata raggiunta su questa scala con AFM rispetto alla microscopia confocale tradizionale.

La figura 6 contiene un'immagine confocale di una colonia di Enterococcus faecalis macchiata con una macchia di struttura cellulare fluorescente verde, che si attacca alla parete cellulare. La figura 5 e la figura 6 dimostrano l'applicabilità della tecnica Conpokal ai microbi oltre alle cellule eucariotiche.

Figura 1: Configurazione di Conpokal.
(A) Schema della tecnica Conpokal. (B) Immagine della configurazione dello strumento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Microscopia a forza atomica delle cellule viventi.
(A) Immagine AFM di due celle HEK. (B) Profilo di altezza (linea verde in A) di una cella HEK che indica che l'altezza della cella è piuttosto grande a 10 μm. (C) Scarsa immagine AFM di una cellula astrocita in cui il piezo AFM è fuori portata all'apice della cellula e vi sono prove di imaging inverso dell'estremità a sbalzo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Microscopia confocale e a campo luminoso delle cellule viventi.
(A) Microscopia confocale a scansione laser di cellule HEK viventi macchiate con una macchia nucleare (blu fluorescente), una macchia di microtubulo (verde fluorescenza) e una macchia di membrana lipofila (rosso fluorescente). (B) Corrispondente immagine ottica a campo luminoso. Le barre di scala sono 10 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Confronto dei rendering 3D dell'AFM e microscopia confocale delle cellule HEK viventi.
(A) Mappa di modulo costruita utilizzando un adattamento del modello Hertz e un profilo parabolico (raggio di 8 nm) per la forma della punta sovrapposta alla ricostruzione 3D della cella da AFM. (B) La corrispondente proiezione 3D della pila z confocale laser con una macchia nucleare (blu fluorescente), una macchia di microtubuli (verde fluorescenza) e una macchia di membrana lipofila (rosso fluorescente). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: AFM del campione di batteri.
(A) Scansione AFM e (B) mappa del modulo misurata di un batterio Streptococcus mutans. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Microscopia confocale del campione di batteri.
Immagine confocale di una colonia di Enterococcus faecalis con macchia di membrana fluorescente verde. La barra di scala è di 5 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Conpokal è una tecnica avanzata ed efficace per la raccolta di immagini di alta qualità e proprietà meccaniche in situ di biomateriali vivi in un ambiente liquido. La capacità di raccogliere immagini morfologiche e topografiche eccezionali combinate con proprietà meccaniche a campione vivo si estende oltre le tipiche tecniche di microscopia elettronica e leggera. Separatamente, un microscopio confocale fornisce funzionalità confocali a campo luminoso, epifluorescenza e scansione laser per ottenere immagini fluorescenti dettagliate e di alta qualità dei campioni. Un AFM fornisce caratterizzazione meccanica, ma senza ottiche ausiliarie diventa difficile navigare nel campione. Con i due sistemi combinati, un utente può raccogliere sia immagini che proprietà meccaniche della stessa identica cella durante l'esperimento, il che è un grande vantaggio rispetto a due strumenti separati. Lo scopo di questo manoscritto è quello di informare e guidare gli utenti sulle ampie capacità del sistema combinato Conpokal per il futuro della biologia, dell'ingegneria e della salute. Il protocollo prevede la preparazione di strumenti, mezzi di coltura, piatti, selezione di microrganismi, procedura AFM, procedura confocale e pulizia. I passaggi più critici per una sessione Conpokal dal vivo e in soluzione di successo sono l'immobilizzazione del campione, la selezione giudiziosa dei suggerimenti e l'esecuzione di macchie dal vivo. La sezione di discussione per questo manoscritto approfondirà le raccomandazioni sulla cultura, i suggerimenti per la risoluzione dei problemi e le linee guida operative e il lavoro futuro per la tecnica Conpokal. Le raccomandazioni sulla cultura riguarderanno le linee guida sulla cultura del campione, l'immobilizzazione e la colorazione. Suggerimenti e linee guida AFM, confocali e Conpokal discuteranno la selezione e la calibrazione dei suggerimenti, la risoluzione, le limitazioni e il funzionamento quasi simultaneo. Il lavoro futuro comprende le prospettive e il potenziale per i futuri percorsi di ricerca.

Il protocollo copre la coltura, il sondaggio e l'imaging di campioni di cellule vive e batteri fissi. Una sfida presente quando si conduce AFM in fusti liquidi da ostruzione del movimento a sbalzi a causa dell'ostacolo del campione e della resistenza idrodinamica. Se il campione non è ben aderito al substrato, c'è il potenziale per l'incrostazione del sbalzino da parte di sezioni del campione che galleggiano nel liquido. In tal caso, le misurazioni sono compromesse poiché sono una supposizione di aderenza elastica e proprietà micromeccaniche del campione. Le cellule HEK non sono state trattate con fissivo, tuttavia, S. mutans ed E. faecalis richiedono un'ulteriore immobilizzazione, simile ad altre cellule procariotiche. I batteri scelti hanno mostrato un movimento attivo che ostacolava il sondaggio cellulare e l'imaging, quindi i campioni sono stati fissati delicatamente, chimicamente per promuovere l'immobilizzazione. Esistono alternative alla fissazione chimica, come le membrane filtranti che intrappolano fisicamente singole cellule nei pori⁷⁵.

La selezione della punta è anche un componente critico per l'impostazione e il funzionamento dell'AFM. Quando si ricercano proprietà meccaniche basate sulla deformazione del biomateriale, si deve considerare la rigidità a sbalzi e la rigidità del materiale, che è un compito non banale. L'obiettivo principale è quello di abbinare al meglio la rigidità del materiale con la rigidità del sbalzino selezionato. Se il sbalzino è molto più morbido del campione, sarà soggetto a troppa deflessione. Se il cantilever è più rigido del campione, il rilevatore AFM potrebbe non essere in grado di catturare deflessioni così piccole. Si raccomanda che quando si seleziona un cantilever AFM adatto, scegliere in base all'applicazione sperimentale. Per raccogliere immagini dettagliate in modalità di contatto intermittente, le punte AFM entro un intervallo di 0,1 - 0,3 N/m per rigidità e raggio di punta entro 5 nm - 100 nm sono efficaci per l'imaging di cellule vive. Si consigliano piccole punte coniche. Le punte affilate forniscono una piccola area di contatto e la possibilità di indentare ulteriormente la raccolta di piccoli dettagli e caratteristiche nella morfologia del^{campione 76.} Tuttavia, le punte affilate possono anche essere problematiche in quanto sono inclini a forare campioni quando le impostazioni(ad esempio,set point, pixel time, velocità di avvicinamento) richiedono un rientro troppo o l'indentazione è troppo veloce. Per evitare effetti ad alta velocità di deformazione, indurimento della deformazione locale vicino a una punta affilata, o semplicemente per controllare l'area di contatto e la velocità di avvicinamento, molti scelgono di utilizzare la spettroscopia di forza con una punta colloidale per misurare un modulo elastico.

Le punte AFM entro un intervallo di 0,01 - 1,0 N/m per rigidità e raggio di punta entro 1 - 5 μm sono consigliate per misurare la forma elastica delle cellule viventi. Grandi dimensioni di punta, tipicamente colloidi di vetro, forniscono un'area di contatto nota ed è improbabile che forno la cellula mentre sono in contatto. I cantilever rettangolari sono preferiti rispetto a triangolari perché durante la calibrazione, il metodo senza contatto può essere utilizzato per la geometria rettangolare rispetto alla calibrazione basata sul contatto per geometrie triangolari. Inoltre, a causa della delicatezza delle punte AFM, si consiglia all'operatore di implementare pinzette con punte in gomma per ridurre il potenziale di danneggiare il delicato chip AFM o il blocco di montaggio. Altri parametri da tenere a mente includono la velocità di avvicinamento della punta AFM e la quantità di indentazione nel campione. Una buona linea guida è quella di mantenere l'indentazione a circa il 10% dello spessore (o dell'altezza) del campione e scegliere una velocità che precluda la potenziale resistenza idrodinamica sperimentata dal cantilever³⁸.

Gli intricati strumenti sperimentali in genere sono disponibili con blocchi stradali che richiedono la risoluzione dei problemi nella configurazione, nella calibrazione e nel funzionamento dello strumento. L'arresto anomalo della punta o del sbalzino AFM nel campione o nel substrato del campione è un errore comune per i nuovi utenti. Per evitare questo problema, il protocollo suggerisce di sostenere il cantilever out 2000 μm. Questo passaggio assicura che la punta non venga a contatto con il fondo del piatto se l'utente precedente ha dimenticato di eseguire il backup della punta durante la pulizia dopo la sperimentazione. Tuttavia, la distanza di 2000 μm è stata scelta per il portapiac piatti selezionato utilizzato in questo protocollo. Potrebbe essere necessario selezionare una gamma diversa, più grande o più piccola, a seconda dello stile del portapiacenne utilizzato. Durante l'allineamento del laser e del rivelatore, il protocollo menziona la regolazione di una manopola speculare per massimizzare il segnale di somma. Una manopola di regolazione dello specchio potrebbe non essere presente su tutti gli AMM. Se presente, tuttavia, un modo per manipolare lo strumento per risolvere i problemi di un segnale a bassa somma è quello di regolare la manopola dello specchio, utilizzata per tenere conto del mezzo in cui avrà luogo la scansione; liquido(ad esempio, acqua,mezzi, PBS) o aria. A causa della differenza nell'indice di rifrazione per la luce attraverso l'aria e attraverso il liquido, potrebbe essere necessario regolare la manopola dello specchio. La massima sensibilità di piegatura del sbalzino AFM sarà nella posizione della punta AFM, pertanto, la luce laser, che restituisce la posizione di flessione attraverso il suo posizionamento su un fotodiodo, deve essere posizionata nella posizione della punta AFM. A seconda della punta AFM scelta, il valore del segnale di somma potrebbe variare da 0,3 a 3,0 V. Un rivestimento posteriore sul cantilever AFM come Cr-Au o Al aumenterà il segnale di somma e la sensibilità della misurazione.

La geometria della punta è pertinente quando si completa la calibrazione della punta durante il funzionamento AFM. È stato osservato un buon accordo tra la calibrazione senza contatto e il contatto. Se il cantilever AFM scelto non è rettangolare, sarà necessario eseguire la calibrazione del contatto. Tenere presente che il mezzo in cui la punta è calibrata deve essere lo stesso del mezzo campione. Se questi fluidi differiscono, l'utente deve ricalibrare. Quando si utilizzano le punte AFM in liquido, la frequenza misurata dal sistema deve essere da un quarto a un terzo di quella della frequenza di risonanza naturale denotata dal produttore. Un buon modo per verificare che il sistema ha calibrato correttamente la punta è verificare i valori all'interno del file di rumore termico generato. Verificare che il file sia salvato nella cartella appropriata. Se il sistema ha problemi di calibrazione o vengono fuori valori non probabili, ricalibrare o regolare leggermente la posizione del laser, quindi ricalibrare.

Un'altra causa di segnale a somma scadente può essere dovuta all'allineamento a sbalzi AFM. Quando il chip AFM è montato nel blocco di vetro, è essenziale che la punta del sbalzino rimanga all'interno della piccola finestra laser (area vetro liscia). Se il chip è troppo avanti, l'angolo in cui il cantilever riposa naturalmente può causare un problema con il riflesso dal cantilever, mancando il fotodetetico e risultando in un segnale a somma scadente. Se il chip è troppo indietro, il laser non sarà in grado di riflettere sul retro del cantilever, causando un segnale di scarsa somma. Per questi motivi, potrebbe essere necessario regolare il chip AFM montato. Inoltre, si verifica un altro problema che può verificarsi con l'altezza del campione. Lo strumento AFM utilizzato in questo protocollo ha un intervallo piezo z massimo (altezza) di 15 μm. Se un utente rileva che il software non è in grado di raccogliere i dati sull'altezza e forzare le mappe in un determinato pixel, verrà visualizzata una casella nera che indica che il sistema non è nel raggio d'azione (Figura 2C). Un modo per problemi a sparare a questo problema è impostare l'altezza del piezo su un valore inferiore, come 2 o 3 μm, quindi la maggior parte dell'intervallo di 15 μm si impegna a mappare l'altezza prevista della cella. Questa tecnica dovrebbe, nella maggior parte degli esperimenti relativi alle cellule o ai batteri, risolvere il problema associato all'intervallo z.

Gli sperimentalisti che richiedono un intervallo z esteso per campioni alti con altezze superiori a 10 - 15 μm potrebbero dover perseguire un modulo aggiuntivo sull'AFM. I produttori AFM hanno questa opzione disponibile a costi aggiuntivi per la maggior parte dei sistemi. Estendendo l'intervallo z, lo sperimentalista ha la disponibilità di scansionare campioni considerati alti sulla micro-scala con pochi problemi per valori fuori intervallo o modifica del motore piezo AFM. Sebbene questi moduli costino di più, alcuni, a seconda del produttore, possono offrire un'altezza aggiuntiva, fino a 100 μm nella direzione z. Confocal è ancora possibile con campioni più alti se l'utente ha una lunga distanza di lavoro, un obiettivo ad alto ingrandimento o è disposto a utilizzare un obiettivo d'aria, forse un 20x o 40x. Abbassando l'ingrandimento oggettivo del microscopio, la distanza di lavoro aumenta, guadagnando distanza per visualizzare l'apice di un campione più alto. Questa modifica a un obiettivo di ingrandimento inferiore sacrificherà la risoluzione. Nell'impostazione Conpokal di cui a questo manoscritto, l'obiettivo 60x TIRF (total internal reflection fluorescence) ha una distanza di lavoro di quasi 100 μm oltre il coverslip del piatto campione con fondo di vetro.

Per quanto riguarda il microscopio confocale di cui al presente manoscritto, vengono discusse alcune importanti disposizioni. Il sistema confocale utilizzato per la produzione delle figure in questo manoscritto ha implementato un obiettivo di olio TIRF 60x con un'apertura numerica di 1,49. Le linee laser a lunghezze d'onda di eccitazione a 405 nm, 488 nm e 561 nm sono state utilizzate per l'imaging di campioni di cellule vive, mostrate nella figura 3 e nella figura 4. Il limite di diffrazione del microscopio confocale può essere determinato usando l'equazione di risoluzione di Abbe, Risoluzione di Abbe(x,y) = λ/2NA, dove λ è la lunghezza d'onda di eccitazione per Alexa 488, a 488 nm, e NA è l'apertura numerica per il condensatore confocale, che è 0,3. Pertanto, viene determinata una risoluzione assiale di 272 nm. Per l'imaging a epifluorescenza, si ritiene che due casi determinino la risoluzione in cui il foro stenopeico è impostato su un'unità ariosa (UA) e 0,5 UA. In quest'ultimo caso, il foro stenopeica è chiuso in modo tale che si verifichi una perdita di luce significativa, ma la risoluzione aumenta. Il software confocale calcola risoluzioni native e assiali successive a 170 nm e 290 nm per il foro stenopeica a 0,5 UA e 200 nm e 370 nm per il foro stenopeica a 1 UA, rispettivamente. Le aberrazioni sferiche introdotte nel sistema possono essere contabilizzate attraverso un processo di deconvoluzione per aumentare il contrasto e la risoluzione nelle immagini al microscopio. A causa delle limitazioni di diffrazione inerenti ai microscopi confocali, l'immagine confocale della colonia batterica nella figura 6 manca della risoluzione corrispondente per i dettagli visti nella scansione AFM dei batteri nella figura 5. AFM fornisce l'accesso a caratteristiche e dettagli su scala nanometrica che è difficile da catturare con un microscopio confocale. Tuttavia, a seconda della risoluzione di fluorescenza richiesta, la figura 5 e la figura 6 dimostrano l'applicabilità della tecnica Conpokal ai microbi oltre alle cellule eucariotiche.

Un vantaggio dell'utilizzo di un microscopio confocale consente all'operatore di raccogliere immagini 3D di regioni specifiche in un campione con dettagli nitidi. Queste immagini sono correlate con l'AFM visualizzando la superficie che è stata sondata tramite l'immagine AFM e una scansione confocale della stessa regione. Poiché il microscopio è invertito, un'immagine di epifluorescenza raccoglie informazioni sulla luce dal lato opposto del campione che è stato sondato. Il foro stenopeico all'interno del sistema confocale aiuta a limitare a un singolo piano da una certa distanza filtrando la luce che proviene dal resto del campione o anche dalla stanza. In sostanza, lo stenopeico aiuta a isolare la luce che torna dal singolo piano di interesse nel campione. Tipicamente, questo piano di interesse deve contenere forti marcatori di fluoroforo perché, per i sistemi confocali invertiti, il rilevamento di singole molecole sarebbe limitato a microscopi confocali ad alta risoluzione. L'illuminazione a epifluorescenza è meno desiderabile a causa del fatto che in modalità di imaging a epifluorescenza, qualsiasi luce del campione riflessa nell'obiettivo viene raccolta e utilizzata per generare l'immagine, quindi, impossibile isolare un singolo piano. Le tecniche confocali forniscono un'immagine a piano singolo più isolata della feature campione in questione a causa del foro^{stenopeico 77}. Se, ad esempio, l'apice di una cellula eucariotica è sondato da AFM, quella stessa superficie può essere isolata con le capacità confocali di scansione laser del microscopio, piuttosto che con la modalità di imaging dell'epifluorescenza. Si consiglia di monitorare lo stato/forma delle cellule durante l'acquisizione dei dati tramite imaging contemporaneamente in modalità di contrasto delle interferenze differenziali con l'aiuto del rilevatore di luce trasmesso e della linea laser a 488 nm. Quando si cattura una pila z del campione, per la procedura sopra descritta, viene regolato solo il guadagno del rivelatore. Qualsiasi cambiamento morfologico nelle cellule durante la misurazione, che non è necessariamente visibile nei canali fluorescenti, indica che gli artefatti vengono introdotti nella misurazione.

La spaziatura ideale tra i piani può essere ottenuta seguendo la raccomandazione software per la lunghezza d'onda più corta utilizzata nella tecnica di imaging. La risoluzione nativa e il rapporto segnale/rumore nei volumi dell'immagine possono essere efficacemente migliorati utilizzando algoritmi di deconvoluzione disponibili nel modulo di elaborazione delle immagini del software di acquisizione. Tuttavia, eseguendo la microscopia fluorescente, la selezione di macchie e coloranti specifici è fondamentale per evitare che lo sbiancamento precoce sul set o il crosstalk si sovrappongano agli spettri di eccitazione / emissione. A volte, un utente può sperimentare un malfunzionamento nella generazione di luce confocale. Se un utente verifica una mancanza di emissione luminosa o linee laser malfunzionante, un modo per risolvere i problemi è ripristinare il sistema, in genere eseguito riavviando il software operativo. Se il problema persiste, il rilevatore di luce trasmesso potrebbe non essere riuscito a spostarsi in entrata o in uscita all'interno del percorso ottico del microscopio a luce. Il ripristino della posizione del rilevatore del trasmettitore può aiutare ad alleviare la raccolta della luce o i problemi di imaging laser.

L'obiettivo dello strumento Conpokal è quello di fornire agli utenti la possibilità di raccogliere informazioni ottiche e basate sulla forza sui biomateriali vivi in un ambiente liquido, contemporaneamente e sulla stessa cella o caratteristica. Questo lavoro descrive esplicitamente come eseguire questi esperimenti in liquido, una casa naturale per molti biomateriali, anche se gli esperimenti a secco possono ancora essere eseguiti usando la strumentazione. Con i campioni preparati nelle piastre di Petri, l'altezza del piatto è un limite. A causa della configurazione del blocco di vetro che contiene il sbalzino AFM, le pareti laterali delle stoviglie devono essere di altezza inferiore a 10 mm; se il piatto è troppo alto, lo strumento non sarà in grado di abbassare la punta AFM sulla superficie del campione o del substrato.

Sebbene vi sia una limitazione per le dimensioni del campione, non vi è alcuna limitazione con lo strumento o le funzionalità software per quanto riguarda un ritardo. Confocale simultaneo e AFM è possibile con i giusti fattori in atto. La limitazione che contribuisce alla sua capacità quasi simultanea si riferisce al rumore generato quando si eseguono contemporaneamente determinate funzioni di microscopia confocale e microscopia a forza atomica. Le vibrazioni dei motori che muovono l'obiettivo del microscopio durante la raccolta di una pila z verranno aggiunte al segnale dalla punta della sonda AFM durante il suo movimento. Il rumore sarà migliorato da un obiettivo di olio, poiché i motori si muovono su e giù nella direzione z per illuminare i piani sequenziali nel campione. Pertanto, il protocollo consigliato include la raccolta sequenziale di scansioni AFM e immagini confocali dello stack z. Il CLSM simultaneo e l'AFM richiederebbero l'imaging stazionario con il confocale, tuttavia, con la tecnica attuale, il tempo di ritardo per i due strumenti potrebbe essere breve fino a decine di secondi. Il tempo effettivo per passare dall'operazione AFM all'imaging confocale è stato di circa 2-4 minuti per le immagini raccolte nella figura 2A e nella figura 4B. Questo valore è stato determinato sottraendo i due periodi di tempo di raccolta delle immagini dal tempo totale di 33 minuti, che include il tempo per iniziare e completare la scansione AFM, cambiare modalità strumento per attivare l'imaging confocale e iniziare e completare lo stack z dell'immagine confocale.

Il futuro di Conpokal mira a esplorare nuove relazioni struttura-funzione oltre a una visione approfondita dei processi a cella singola. Ad esempio, la sperimentazione di trattamenti farmacologici in situ su campioni cellulari o batterici per determinare gli effetti dell'elasticità cellulare sarebbe un progresso nei campi dei biomateriali, della biologia e della biomeccanica. La terapia di trattamento nel piatto campione durante l'imaging e il sondaggio fornirebbe la conoscenza di come il campione risponde alle terapie in un ambiente vivo e attentamente controllato, nel tempo. Incorporare un nuovo farmaco o una sfida ambientale amplierebbe la comprensione di come il citoscheletro o la posizione dell'organelli influenzi la locomozione, la topologia, la rigidità, ecc. Un altro potenziale avanzamento di Conpokal è la capacità di avere un controllo ambientale completo del sistema. L'attuale Conpokal menzionato in questo protocollo è alloggiato all'interno di un involucro acustico progettato per ridurre il rumore dall'interno del laboratorio. L'avanzamento di questo alloggiamento fornirebbe la capacità di testare all'interno, forse, di uno o una combinazione di fattori, non limitati a quelli come un ambiente sterile, a temperatura controllata o anche a gravità variabile. Allo stato attuale, il metodo Conpokal fornisce un approccio efficace e utile per caratterizzare biomateriali vivi e liquidi, ma il futuro della tecnica farà avanzare ulteriormente queste capacità.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cabina acustica	JPK-Bruker	Camera di recinzione acustica	utilizzata per mitigare il rumore
BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye	Millipore Sigma	SCT142	Utilizzato per marcare i microtubuli nelle cellule di mammifero
CP-qp-CONT-BSG Punte AFM	NanoAndMore	CP-qp-CONT-BSG-B	Punte AFM collodiali buone per misurazioni del modulo su campioni biologici
Dil Stain (1,1'-Diottadecil-3,3,3',3'-Tetrametilindocarbocianina perclorato ('DiI'; DiIC18(3)))	ThermoFischer Scientific	D282	Utilizzato per marcare la membrana plasmatica delle cellule di mammifero
Dulbecco's Modified Eagle Medium	VWR	VWRL0100-0500	Componente del terreno di coltura cellulare
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco	ThermoFisher Scientific	A1285601	Utilizzato per simulare l'ambiente biologico
Fetale Siero bovino	Fischer Scientific	45000-736	Componente dei terreni di coltura cellulare
Fisher BioReagents Terreni di microbiologia Additivi: Estratto di lievito	Fischer Scientific	BP1422-500	Componente del terreno di coltura batterica
FluoroDish Cell Culture Dish World	Precision Instruments (WPI)	FD35-100	Piastre con fondo di vetro le cui pareti laterali sono inferiori a 10 mm, necessarie per il pieno funzionamento dell'acido nucleico Nanowizard 4a AFM
Hoechst 33342 colorante	ThermoFischer Scientific	62249	Utilizzato per marcare il nucleo di cellule di mammifero, un buon marcatore nucleare per cellule vive
Rene embrionale umano 293 cellule	ATCC Global Bioresource Center	CRL-1573	Cellule di mammifero utilizzate nel protocollo
Matrigel	VWR	47743-716	Rivestimento in piatto di coltura cellulare
Modello: PFQNM-LC-A-CAL Punte AFM	Bruker	PFQNM-LC-A-CAL	Punte AFM che funzionano bene per campioni che hanno grandi altezze (come le cellule eucariotiche)
NanoWizard 4a	JPK-Bruker	NanoWizard 4a	AFM
Nikon A1 Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon	A1 HD25	Microscopio utilizzato per l'imaging in campo chiaro, epifluorescenza e confocale
PENICILLINA/STREPTOMICINA	VWR	16777-164	Componente dei terreni
di coltura cellularePetriDishHeater	JPK-Bruker	PetriDishHeater	Mantiene la temperatura del campione della piastra di Petri desiderata
qp-BioAC-Cl Punte AFM	Nanosensori	qp-BioAC-Cl-10	Tre diversi cantilever AFM di rigidità variabile
Pinzette sostituibili in fibra di carbonio	Ted Pella Inc.	5051	Utilizzato per posizionare e rimuovere con cura le delicate punte AFM nel blocco di montaggio in vetro
Todd Hewitt Broth Bacto	BD DIFCO Bacterius Ltd	Bacto-249240	Componente del terreno di coltura batterica
Vancomicina, BODIPY FL Coniugato	Thermo Fisher Scientific	V34850	Utilizzato per marcare in modo fluorescente la parete cellulare batterica