Imagerie super-résolution pour étudier la co-localisation des protéines et des marqueurs synaptiques dans les neurones primaires
Summary
Ce protocole montre comment utiliser la microscopie à super résolution pour étudier la co-localisation des protéines dans les cultures neuronales primaires.
Abstract
Les synapses sont les éléments fonctionnels des neurones et leurs défauts ou pertes sont à la base de plusieurs troubles neurodégénératifs et neurologiques. Les études d’imagerie sont largement utilisées pour étudier leur fonction et leur plasticité dans des conditions physiologiques et pathologiques. En raison de leur taille et de leur structure, les études de localisation des protéines nécessitent des techniques d’imagerie à haute résolution. Dans ce protocole, nous décrivons une procédure d’étude dans les neurones primaires la co-localisation des protéines cibles avec des marqueurs synaptiques à un niveau de super-résolution utilisant la microscopie d’illumination structurée (SIM). SIM est une technique d’éclairage à motifs qui double la résolution spatiale de la microscopie à large champ, atteignant un détail d’environ 100 nm. Le protocole indique les contrôles et les paramètres requis pour des études de co-localisation robustes et une vue d’ensemble des méthodes statistiques pour analyser correctement les données d’imagerie.
Introduction
La compréhension et la vue de la synapse a énormément changé depuis sa première description par Foster et Sherrington en 18971. Depuis lors, notre connaissance de la communication neuronale et les processus moléculaires derrière elle a augmenté de façon exponentielle2. Il est devenu clair que les synapses peuvent être considérées comme un système à deux compartiments : un compartiment pré-synaptique contenant des vésicules pour la libération de neurotransmetteurs et un compartiment post-synaptique avec des récepteurs3. Cette vision simpliste, au cours des vingt dernières années, s’est transformée en un réseau complexe de protéines nécessaires pour transduire la liaison des émetteurs en signalisation4.
Les gains dans la compréhension sont en partie dus aux techniques de super-résolution qui ont surmonté la limite de diffraction de la microscopie légère conventionnelle pour convenir à la dimension des synapses mieux5,6,7,8,9,10. En raison de la limite de diffraction, un microscope optique ne peut pas atteindre une résolution supérieure à 200 nm par la suite11,12. Pour contourner cette limite, des techniques de superrésolution ont été créées, en utilisant différentes approches et en atteignant différentes résolutions limites de sous-diffraction : SIM, STED (Stimated Emission Ecution Exceed Microscopy), PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) et STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)13,14. SIM double la résolution spatiale des systèmes de microscopie à large champ à base de laser en insérant une grille de diffraction dans le chemin de faisceaud’excitation 15. La grille mobile diffracts les faisceaux laser pour créer un modèle d’éclairage connu, généralement rayures. Ce motif de lumière volontairement structuré est superposé à la distribution spatiale inconnue du colorant fluorescent (de l’échantillon). Les franges d’interférence formées par les deux modèles codent pour des détails fins autrement indiscernables avec la microscopie normale de large champ. L’image finale super-résolue est obtenue en combinant et décodage avec des méthodes mathématiques plusieurs images brutes du même échantillon obtenus par les traductions et les rotations de la grille de diffraction. La résolution des images super-résolues atteint 100 nm dans le côté et 500 nm dans les directions axiales pour 2D-SIM15 ou 100 nm dans le latéral et 250 nm dans les directions axiales pour 3D-SIM16.
La nouvelle compréhension de la synapse est encore plus importante à la lumière des nombreux troubles neurologiques où le dysfonctionnement synaptique joue un rôle majeur dans l’apparition et la progression17,18. La maladie d’Alzheimer, le syndrome de Down, la maladie de Parkinson, les maladies à prions, l’épilepsie, les troubles du spectre autistique et le syndrome fragile de X, entre autres, ont été liés à des anomalies dans la composition synaptique, la morphologie et la fonction19,20,21,22.
Récemment, à l’aide d’un ensemble d’anticorps spécifiques à sumo, nous avons utilisé sim pour montrer la co-localisation dans les neurones hippocampaux primaires des protéines SUMO avec les marqueurs pré- et post-synaptiques synaptophysine et PSD95 au niveau de super-résolution23. Cela nous a permis de confirmer les preuves biochimiques et confocales de microscopie de la localisation sumo dans les neurones.
Ici, nous décrivons un protocole pour étudier la localisation des protéines dans les neurones primaires hippocampaux de souris. En même temps, ce protocole peut être adapté à différents types de cultures neuronales primaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’élucidation de la structure et de la composition de la synapse est cruciale pour comprendre les processus physiologiques et pathologiques qui régulent la mémoire et la cognition. Alors que dans l’état normal, les synapses sont les éléments constitutifs de la mémoire, ils sont également à la base de troubles neurologiques complexes tels que la maladie d’Alzheimer32. Le protocole décrit ici sert à étudier la co-localisation des protéines neuronales avec une technique de microsco…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Edoardo Micotti pour la critique constructive du manuscrit. Cette étude a été soutenue par BrightFocus A2019296F, par Fondo di Beneficenza – Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), par Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) et par le Sk’odowska-Curie Innovative Training Network (JK).
Materials
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Chemical |
| 70 µm filter | Corning | 352350 | Equiment |
| Alexa | Thermo Fisher Scientific | – | Antibody |
| Antibody SENP1 | Santa Cruz | sc-271360 | Antibody |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Chemical |
| Bovine serum albumin | Merck | 5470 | Chemical |
| CaCl2 | Merck Life Science | 21115 | Chemical |
| Chambered coverslips | Ibidi | 80826 | Equiment |
| DyLight | Thermo Fisher Scientific | – | Antibody |
| FBS (Hyclone) | GIBCO | SH3007002 (CHA1111L) | Serum |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow–green fluorescent | Thermo Fisher Scientific | F8803 | Equiment |
| Glucose | Merck Life Science | G8769 | Chemical |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | Chemical |
| HEPES | Merck Life Science | H3537 | Chemical |
| L-Cystein | Merck Life Science | C6852-25g | Chemical |
| MAP2 | Merck | AB15452 | Antibody |
| MEM | Life Technologies | 21575022 | Medium |
| MgCl | Merck Life Science | M8266 | Chemical |
| NaOH | VWR International | 1,091,371,000 | Chemical |
| Neurobasal A | Life Technologies | 10888022 | Medium |
| N-SIM Super Resolution Microscope | Nikon | – | Instrument |
| Papain | Merck Life Science | P-3125 | Chemical |
| paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Chemical |
| Pen/Strep 10x | Life Technologies | 15140122 | Chemical |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Chemical |
| Poly-L lysine | Sigma | P2636 | Chemical |
| ProLong Diamond Glass Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Chemical |
| PSD95 | NeuroMab | K28/43 | Antibody |
| Round coverglass | Thermo | 12052712 | Equiment |
| SUMO1 | Abcam | ab32058 | Antibody |
| Synaptophysin | Merck | S5768 | Antibody |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | Chemical |
| Trypsin inhibitor | Merck Life Science | T9003-500MG | Chemical |
Riferimenti
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