이 프로토콜은 1 차적인 신경 배양에서 단백질 공동 국소화를 공부하기 위하여 초해상도 현미경 검사를 채택하는 방법을 보여줍니다.
시냅스는 뉴런의 기능적 요소이며 결함이나 손실은 여러 신경 퇴행성 및 신경 장애의 기초입니다. 이미징 연구는 생리학적 및 병리학 적 조건에서 자신의 기능과 가소성을 조사하는 데 널리 사용됩니다. 단백질의 크기와 구조 때문에 고해상도 이미징 기술이 필요합니다. 이 프로토콜에서, 우리는 구조화 된 조명 현미경 검사 (SIM)를 사용하여 초해상도 수준에서 시냅스 마커와 대상 단백질의 공동 국소화를 1 차 뉴런에서 연구하는 절차를 설명합니다. SIM은 광야 현미경 검사법의 공간 해상도를 두 배로 늘려 약 100nm의 세부 사항에 도달하는 패턴 조명 기술입니다. 이 프로토콜은 강력한 공동 지역화 연구에 필요한 제어 및 설정과 이미징 데이터를 제대로 분석하는 통계 방법에 대한 개요를 나타냅니다.
시냅스의 이해와 견해는 1897년 포스터와 셔링턴의 첫 번째 설명 이후1엄청나게 변했다. 그 이후로, 신경 통신및 그 뒤에 분자 프로세스에 대한 우리의 지식은 기하 급수적으로 성장했다2. 시냅스는 신경 전달 물질의 방출을위한 소포를 포함하는 사전 시냅스 구획과수용체3를가진 시냅스 후 구획으로 생각할 수 있다는 것이 분명해졌습니다. 이 단순한 보기는, 지난 20 년 에서, 신호4로송신기 결합을 변환하는 데 필요한 단백질의 복잡한 네트워크로 진화했다.
이해의 이득은 부분적으로 시냅스의 치수에 맞게 종래의 광 현미경 검사법의 회절 한계를 극복슈퍼 해상도 기술로 인해5,,6,,7,,8,,9,,10. 회절 제한으로 인해 광학 현미경은 200 nm 측면11,,12이상의 해상도에 도달할 수 없습니다. 이 한계를 우회하기 위해, 초해상도 기술은 다른 접근 방식을 사용하여 다른 부회절 제한 해상도에 도달했다 : SIM, STED (자극 방출 고갈 현미경 검사), PALM (사진 활성화 국소화 현미경 검사법) 및 STORM (스토세스 광학 재건 현미경)13,,14. SIM은 흥분 빔경로(15)에회절 격자를 삽입하여 레이저 기반 광시야 현미경 시스템의 공간 해상도를 두 배로 합니다. 이동식 격자 는 레이저 빔을 분산시켜 알려진 조명 패턴, 일반적으로 줄무늬를 만듭니다. 이러한 의도적으로 구조화된 광 패턴은 형광염(시료)의 알 수 없는 공간 분포에 중첩된다. 두 패턴에 의해 형성된 간섭 프린지는 일반 광시야 현미경 검사법과 구별할 수 없는 미세한 세부 사항에 대해 인코딩합니다. 최종 슈퍼 해결 된 이미지는 회절 격자의 번역 및 회전에 의해 얻은 동일한 샘플의 여러 원시 이미지를 수학 방법과 결합하고 디코딩하여 얻을 수 있습니다. 수퍼-리졸브 된 이미지의 해상도는 측면 방향에서 100 nm, 측면 방향에서 2D-SIM15 또는 100 nm및 3D-SIM16에대한 축 방향에서 250 nm에 도달한다.
시냅스의 새로운 이해는 시냅스 기능 장애가 발병 및 진행17,,18에서중요한 역할을 하는 많은 신경 장애에 비추어 더욱 중요합니다. 알츠하이머병, 다운증후군, 파킨슨병, 프리온질환, 간질, 자폐스펙트럼장애 및 연약한 X증후군등은 시냅스 조성, 형태학 및기능(19,,20,,21,,22)의이상과 관련이 있다.
최근에는 SUMO 특이적 항체 세트를 사용하여 SIM을 사용하여 수모 단백질의 1차 해마 뉴런에서 시냅틱 마커 시냅토피신 및 PSD95를 초해상도 레벨23에서공동 국소화를 보여주었다. 이것은 우리가 뉴런에 있는 SUMO 현지화의 생화학그리고 공초점 현미경 검사약 증거를 확인하는 것을 가능하게 했습니다.
여기에서, 우리는 마우스 해마 1 차적인 뉴런에 있는 단백질의 현지화를 연구하기 위하여 프로토콜을 기술합니다. 동시에, 이 프로토콜은 1 차적인 신경 문화의 다른 모형에 적응될 수 있습니다.
시냅스의 구조와 구성을 해명하는 것은 기억과 인식을 조절하는 생리학적 및 병리학적 과정을 이해하는 데 매우 중요합니다. 정상 상태에서 시냅스는 기억의 구성 요소이며, 알츠하이머병(32)과같은 복잡한 신경 장애의 기초이기도 합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 SIM에게 불린 초해상도 현미경 기술으로 신경 단백질의 공동 현지화를 공부하는 역할을 합니다. SIM은 특정 조명 ?…
The authors have nothing to disclose.
저자는 원고의 건설적인 비판에 대한 도아르도 미코티에게 감사드립니다. 이 연구는 브라이트 포커스 A2019296F에 의해 지원되었다, 폰도 디 베네피첸자에 의해 – 그루프포 인테사 산파올로 (LC), 라 라이스사 바이오 메디카 당 폰다지오네 지역 (Care4NeuroRare CP_20 / 2018) (CN) 마리 Skłodowska-Curie 혁신적인 교육 네트워크 (JK)에 의해 지원되었다.
0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Chemical |
70 µm filter | Corning | 352350 | Equiment |
Alexa | Thermo Fisher Scientific | – | Antibody |
Antibody SENP1 | Santa Cruz | sc-271360 | Antibody |
B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Chemical |
Bovine serum albumin | Merck | 5470 | Chemical |
CaCl2 | Merck Life Science | 21115 | Chemical |
Chambered coverslips | Ibidi | 80826 | Equiment |
DyLight | Thermo Fisher Scientific | – | Antibody |
FBS (Hyclone) | GIBCO | SH3007002 (CHA1111L) | Serum |
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow–green fluorescent | Thermo Fisher Scientific | F8803 | Equiment |
Glucose | Merck Life Science | G8769 | Chemical |
Glutamax | GIBCO | 35050061 | Chemical |
HEPES | Merck Life Science | H3537 | Chemical |
L-Cystein | Merck Life Science | C6852-25g | Chemical |
MAP2 | Merck | AB15452 | Antibody |
MEM | Life Technologies | 21575022 | Medium |
MgCl | Merck Life Science | M8266 | Chemical |
NaOH | VWR International | 1,091,371,000 | Chemical |
Neurobasal A | Life Technologies | 10888022 | Medium |
N-SIM Super Resolution Microscope | Nikon | – | Instrument |
Papain | Merck Life Science | P-3125 | Chemical |
paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Chemical |
Pen/Strep 10x | Life Technologies | 15140122 | Chemical |
phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Chemical |
Poly-L lysine | Sigma | P2636 | Chemical |
ProLong Diamond Glass Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Chemical |
PSD95 | NeuroMab | K28/43 | Antibody |
Round coverglass | Thermo | 12052712 | Equiment |
SUMO1 | Abcam | ab32058 | Antibody |
Synaptophysin | Merck | S5768 | Antibody |
Triton X-100 | Merck | T8787 | Chemical |
Trypsin inhibitor | Merck Life Science | T9003-500MG | Chemical |