Denne protokollen viser hvordan du bruker superoppløsningsmikroskopi for å studere proteinkon-lokalisering i primære nevronale kulturer.
Synapser er de funksjonelle elementene i nevroner og deres defekter eller tap er på grunnlag av flere nevrodegenerative og nevrologiske lidelser. Imaging studier er mye brukt til å undersøke deres funksjon og plastisitet i fysiologiske og patologiske forhold. På grunn av deres størrelse og struktur krever lokaliseringsstudier av proteiner høyoppløselige bildeteknikker. I denne protokollen beskriver vi en prosedyre for å studere i primære nevroner samtidig lokalisering av målproteiner med synaptiske markører på et superoppløsningsnivå ved hjelp av strukturert belysningmikroskopi (SIM). SIM er en mønstret lys belysning teknikk som dobler romlig oppløsning av bredfelt mikroskopi, nå en detalj på rundt 100 nm. Protokollen angir de nødvendige kontrollene og innstillingene for robuste sam lokaliseringsstudier og en oversikt over de statistiske metodene for å analysere bildedataene riktig.
Forståelsen og synet av synapse har endret seg enormt siden den første beskrivelsen av Foster og Sherrington i 18971. Siden da har vår kunnskap om nevronal kommunikasjon og de molekylære prosessene bak den vokst eksponentielt2. Det har blitt klart at synapser kan tenkes som et to-roms system: et pre-synaptisk rom som inneholder vesikler for frigjøring av nevrotransmittere og et postsynaptisk rom medreseptorer 3. Dette forenklede synet har de siste tjue årene utviklet seg til et komplekst nettverk av proteinene som kreves for å transdusere senderbinding til å signalisere4.
Gevinsten i forståelsen skyldes delvis superoppløsningsteknikker som overvant diffraksjonsgrensen for konvensjonell lett mikroskopi som passer dimensjonen av synapser bedre5,,6,,7,,8,,9,,10. På grunn av diffraksjonsgrensen kan ikke et optisk mikroskop nå en oppløsning over 200 nm side11,,12. For å omgå denne grensen ble det opprettet superoppløsningsteknikker ved hjelp av ulike tilnærminger og når forskjellige sub-diffraksjonsgrenseoppløsninger: SIM, STED (Stimulert utslippsdeplesjonsmikroskopi), PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) og STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)13,14. SIM dobler den romlige oppløsningen av laserbaserte bredfelts mikroskopisystemer ved å sette inn en diffraksjonsrist i eksitasjonsstrålebanen15. Den bevegelige risten diffracts laserstrålene for å skape et kjent belysningsmønster, vanligvis striper. Dette med hensikt strukturerte lysmønsteret er lagt over til den ukjente romlige fordelingen av fluorescerende fargestoff (av prøven). Interferenskantene dannet av de to mønstrene koder for ellers umulige fine detaljer med normal bredfeltmikroskopi. Det endelige super-løst bildet oppnås ved å kombinere og dekoding med matematiske metoder flere råbilder av samme prøve oppnådd av oversettelser og rotasjoner av diffraksjonsristet. Oppløsningen av super-løst bilder når 100 nm i lateral og 500 nm i aksial retninger for 2D-SIM15 eller 100 nm i sideveis og 250 nm i aksial retninger for 3D-SIM16.
Den nye forståelsen av synapsen er enda viktigere i lys av de mange nevrologiske lidelsene der synaptisk dysfunksjon spiller en viktig rolle i utbruddet ogprogresjon 17,18. Alzheimers sykdom, Down syndrom, Parkinsons sykdom, prion sykdommer, epilepsi, autisme spektrum lidelser og skjøre X syndrom blant annet har vært knyttet til abnormiteter i synaptisk sammensetning, morfologiog funksjon 19,20,21,22.
Nylig, ved hjelp av et sett med SUMO-spesifikke antistoffer, brukte vi SIM til å vise co-lokalisering i primære hippocampal nevroner av SUMO proteiner med pre- og post-synaptiske markører synaptophysin og PSD95 på superoppløsningnivå 23. Dette gjorde oss i stand til å bekrefte biokjemisk og konfokal mikroskopi bevis på SUMO lokalisering i nevroner.
Her beskriver vi en protokoll for å studere lokalisering av proteiner i mus hippocampal primære nevroner. Samtidig kan denne protokollen tilpasses ulike typer primære nevronale kulturer.
Belyse strukturen og sammensetningen av synapsen er avgjørende for å forstå de fysiologiske og patologiske prosessene som regulerer hukommelse og kognisjon. Mens de er i normal tilstand, synapser er byggesteinene i minnet, de ligger også til grunn for komplekse nevrologiske lidelser som Alzheimers sykdom32. Protokollen som er beskrevet her tjener til å studere co-lokalisering av nevronale proteiner med en superoppløsning mikroskopi teknikk kalt SIM. Ved hjelp av et bestemt belysningsmønster…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke Edoardo Micotti for konstruktiv kritikk av manuskriptet. Denne studien ble støttet av BrightFocus A2019296F, av Fondo di Beneficenza – Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), av Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) og av Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network (JK).
0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Chemical |
70 µm filter | Corning | 352350 | Equiment |
Alexa | Thermo Fisher Scientific | – | Antibody |
Antibody SENP1 | Santa Cruz | sc-271360 | Antibody |
B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Chemical |
Bovine serum albumin | Merck | 5470 | Chemical |
CaCl2 | Merck Life Science | 21115 | Chemical |
Chambered coverslips | Ibidi | 80826 | Equiment |
DyLight | Thermo Fisher Scientific | – | Antibody |
FBS (Hyclone) | GIBCO | SH3007002 (CHA1111L) | Serum |
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow–green fluorescent | Thermo Fisher Scientific | F8803 | Equiment |
Glucose | Merck Life Science | G8769 | Chemical |
Glutamax | GIBCO | 35050061 | Chemical |
HEPES | Merck Life Science | H3537 | Chemical |
L-Cystein | Merck Life Science | C6852-25g | Chemical |
MAP2 | Merck | AB15452 | Antibody |
MEM | Life Technologies | 21575022 | Medium |
MgCl | Merck Life Science | M8266 | Chemical |
NaOH | VWR International | 1,091,371,000 | Chemical |
Neurobasal A | Life Technologies | 10888022 | Medium |
N-SIM Super Resolution Microscope | Nikon | – | Instrument |
Papain | Merck Life Science | P-3125 | Chemical |
paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Chemical |
Pen/Strep 10x | Life Technologies | 15140122 | Chemical |
phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Chemical |
Poly-L lysine | Sigma | P2636 | Chemical |
ProLong Diamond Glass Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Chemical |
PSD95 | NeuroMab | K28/43 | Antibody |
Round coverglass | Thermo | 12052712 | Equiment |
SUMO1 | Abcam | ab32058 | Antibody |
Synaptophysin | Merck | S5768 | Antibody |
Triton X-100 | Merck | T8787 | Chemical |
Trypsin inhibitor | Merck Life Science | T9003-500MG | Chemical |