Super-Resolution Imaging att studera samlokalisering av proteiner och synaptiska markörer i primära nervceller
Summary
Detta protokoll visar hur man använder super-upplösning mikroskopi för att studera protein medlokalisering i primära neuronala kulturer.
Abstract
Synapser är de funktionella elementen i nervceller och deras defekter eller förluster ligger på grundval av flera neurodegenerativa och neurologiska sjukdomar. Imaging studier används ofta för att undersöka deras funktion och plasticitet i fysiologiska och patologiska förhållanden. På grund av deras storlek och struktur kräver lokaliseringsstudier av proteiner högupplösta avbildningstekniker. I detta protokoll beskriver vi ett förfarande för att studera i primära nervceller samlokalisering av målproteiner med synaptiska markörer på en super-upplösning nivå med hjälp av strukturerad belysning mikroskopi (SIM). SIM är en mönstrad ljus belysning teknik som fördubblar den rumsliga upplösningen av breda fält mikroskopi, nå en detalj på cirka 100 nm. Protokollet anger de kontroller och inställningar som krävs för robusta samlokaliseringsstudier och en översikt över de statistiska metoderna för att analysera bilddata ordentligt.
Introduction
Förståelsen och synen på synapsen har förändrats enormt sedan dess första beskrivning av Foster och Sherrington 18971. Sedan dess har vår kunskap om neuronal kommunikation och de molekylära processerna bakom det vuxit exponentiellt2. Det har blivit tydligt att synapser kan ses som ett tvåfackssystem: ett pre-synapsfack som innehåller vesiklar för frisättning av signalsubstanser och ett postsynapsfack med receptorer3. Denna förenklade syn, under de senaste tjugo åren, har utvecklats till ett komplext nätverk av de proteiner som krävs för att transduce sändarbindning till signalering4.
Vinsterna i förståelsen beror delvis på super-upplösning tekniker som övervann diffraktion gränsen för konventionell ljusmikroskopi för att passa dimensionen av synapser bättre5,6,7,8,9,10. På grund av diffraktionsgränsen kan ett optiskt mikroskop inte nå en upplösning över 200 nm i lateritet11,12. För att kringgå denna gräns, super-upplösning tekniker skapades, med hjälp av olika tillvägagångssätt och nå olika sub-diffraktion gräns upplösningar: SIM, STED (Stimulerad emission depletion mikroskopi), PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) och STORM (Stokastisk Optisk Rekonstruktion Mikroskopi)13,14. SIM fördubblar den rumsliga upplösningen hos laserbaserade mikroskopisystem med bredfältsbaserad genom att sätta in ett diffraktionsgaller i magnetiseringsstrålensväg 15. Den rörliga galler diffracts laserstrålarna för att skapa en känd belysning mönster, vanligtvis ränder. Detta avsiktligt strukturerade ljusmönster läggs ovanpå den okända rumsliga fördelningen av det fluorescerande färgämnet (av provet). De störningar fransar som bildas av de två mönster koda för annars omöjlig att skilja fina detaljer med normala wide-field mikroskopi. Den slutliga super-lösta bilden erhålls genom att kombinera och avkoda med matematiska metoder flera råa bilder av samma prov som erhållits genom översättningar och rotationer av diffraction galler. Upplösningen på de super-lösta bilderna når 100 nm i den laterala och 500 nm i axiella riktningar för 2D-SIM15 eller 100 nm i den laterala och 250 nm i axial riktningar för 3D-SIM16.
Den nya förståelsen av synapsen är ännu viktigare i ljuset av de många neurologiska sjukdomar där synaptisk dysfunktion spelar en stor roll i debuten och progression17,18. Alzheimers sjukdom, Downs syndrom, Parkinsons sjukdom, prionsjukdomar, epilepsi, autismspektrumstörningar och bräckligt X syndrom bland andra har kopplats till avvikelser i synapssammansättning, morfologioch funktion 19,20,21,22.
Nyligen, med hjälp av en uppsättning SUMO-specifika antikroppar, vi använde SIM för att visa samlokalisering i primära hippocampus nervceller av SUMO-proteinerna med pre- och post-synapsmarkörer synaptophysin och PSD95 på super-upplösning nivå23. Detta gjorde det möjligt för oss att bekräfta biokemiska och konfokala mikroskopi bevis på SUMO lokalisering i nervceller.
Här beskriver vi ett protokoll för att studera lokalisering av proteiner i mus hippocampus primära nervceller. Samtidigt kan detta protokoll anpassas till olika typer av primära neuronala kulturer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Att belysa synapsens struktur och sammansättning är avgörande för att förstå de fysiologiska och patologiska processer som reglerar minne och kognition. Även i det normala tillståndet, synapser är byggstenarna i minnet, de ligger också bakom komplexa neurologiska sjukdomar såsom Alzheimers sjukdom32. Protokollet som beskrivs här tjänar till att studera samlokalisering av neuronala proteiner med en super-upplösning mikroskopi teknik som kallas SIM. Med hjälp av ett visst ljusmönster…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Edoardo Micotti för konstruktiv kritik av manuskriptet. Denna studie stöddes av BrightFocus A2019296F, av Fondo di Beneficenza – Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), av Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) och av Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network (JK).
Materials
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Chemical |
| 70 µm filter | Corning | 352350 | Equiment |
| Alexa | Thermo Fisher Scientific | – | Antibody |
| Antibody SENP1 | Santa Cruz | sc-271360 | Antibody |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Chemical |
| Bovine serum albumin | Merck | 5470 | Chemical |
| CaCl2 | Merck Life Science | 21115 | Chemical |
| Chambered coverslips | Ibidi | 80826 | Equiment |
| DyLight | Thermo Fisher Scientific | – | Antibody |
| FBS (Hyclone) | GIBCO | SH3007002 (CHA1111L) | Serum |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow–green fluorescent | Thermo Fisher Scientific | F8803 | Equiment |
| Glucose | Merck Life Science | G8769 | Chemical |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | Chemical |
| HEPES | Merck Life Science | H3537 | Chemical |
| L-Cystein | Merck Life Science | C6852-25g | Chemical |
| MAP2 | Merck | AB15452 | Antibody |
| MEM | Life Technologies | 21575022 | Medium |
| MgCl | Merck Life Science | M8266 | Chemical |
| NaOH | VWR International | 1,091,371,000 | Chemical |
| Neurobasal A | Life Technologies | 10888022 | Medium |
| N-SIM Super Resolution Microscope | Nikon | – | Instrument |
| Papain | Merck Life Science | P-3125 | Chemical |
| paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Chemical |
| Pen/Strep 10x | Life Technologies | 15140122 | Chemical |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Chemical |
| Poly-L lysine | Sigma | P2636 | Chemical |
| ProLong Diamond Glass Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Chemical |
| PSD95 | NeuroMab | K28/43 | Antibody |
| Round coverglass | Thermo | 12052712 | Equiment |
| SUMO1 | Abcam | ab32058 | Antibody |
| Synaptophysin | Merck | S5768 | Antibody |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | Chemical |
| Trypsin inhibitor | Merck Life Science | T9003-500MG | Chemical |
Riferimenti
- Foster, M., Sherrington, C. S. . A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.). , (1897).
- Choquet, D., Triller, A. The Dynamic Synapse. Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).
- McAllister, A. K. Dynamic Aspects of CNS Synapse Formation. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 425-450 (2007).
- Yuzaki, M. Two Classes of Secreted Synaptic Organizers in the Central Nervous System. Annual Review of Physiology. 80 (1), 243-262 (2018).
- Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
- Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
- Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).
- Badawi, Y., Nishimune, H. Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses. Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).
- Scalisi, S., Barberis, A., Petrini, E. M., Zanacchi, F. C., Diaspro, A. Unveiling the Inhibitory Synapse Organization Using Superresolution Microscopy. Biophysical Journal. 116 (3), 133 (2019).
- Yang, X., Specht, C. G. Subsynaptic Domains in Super-Resolution Microscopy: The Treachery of Images. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, (2019).
- Monro, T. Beyond the diffraction limit. Nature Photonics. 3 (7), 361 (2009).
- Won, R. Eyes on super-resolution. Nature Photonics. 3 (7), 368-369 (2009).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6 (1), 27290 (2016).
- Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Brose, N., O’Connor, V., Skehel, P. Synaptopathy: dysfunction of synaptic function. Biochemical Society Transactions. 38 (2), 443-444 (2010).
- Tyebji, S., Hannan, A. J. Synaptopathic mechanisms of neurodegeneration and dementia: Insights from Huntington’s disease. Progress in Neurobiology. 153, 18-45 (2017).
- Won, H., Mah, W., Kim, E. Autism spectrum disorder causes, mechanisms, and treatments: focus on neuronal synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, (2013).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. The State of Synapses in Fragile X Syndrome. The Neuroscientist. 15 (5), 549-567 (2009).
- Pavlowsky, A., Chelly, J., Billuart, P. Emerging major synaptic signaling pathways involved in intellectual disability. Molecular Psychiatry. 17 (7), 682-693 (2012).
- Senatore, A., Restelli, E., Chiesa, R. Synaptic dysfunction in prion diseases: a trafficking problem. International Journal of Cell Biology. 2013, 543803 (2013).
- Colnaghi, L., et al. Super Resolution Microscopy of SUMO Proteins in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Müller, M., Mönkemöller, V., Hennig, S., Hübner, W., Huser, T. Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ. Nature Communications. 7 (1), 10980 (2016).
- Ball, G., et al. SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy. Scientific Reports. 5 (1), 15915 (2015).
- Schaefer, L. H., Schuster, D., Schaffer, J. Structured illumination microscopy: artefact analysis and reduction utilizing a parameter optimization approach. Journal of Microscopy. 216 (2), 165-174 (2004).
- Culley, S., et al. NanoJ-SQUIRREL: quantitative mapping and minimisation of super-resolution optical imaging artefacts. Nature Methods. 15 (4), 263-266 (2018).
- Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. Measurement of co-localization of objects in dual-colour confocal images. Journal of Microscopy. 169 (3), 375-382 (1993).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224, 213-232 (2006).
- Bae, J. R., Kim, S. H. Synapses in neurodegenerative diseases. BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).
- Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. Super-resolution Microscopy Approaches for Live Cell Imaging. Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Karras, C., et al. Successful optimization of reconstruction parameters in structured illumination microscopy – A practical guide. Optics Communications. 436, 69-75 (2019).
- Bereczki, E., et al. Synaptic markers of cognitive decline in neurodegenerative diseases: a proteomic approach. Brain: A Journal of Neurology. 141 (2), 582-595 (2018).
- Gilestro, G. F., Tononi, G., Cirelli, C. Widespread Changes in Synaptic Markers as a Function of Sleep and Wakefulness in Drosophila. Science. 324 (5923), 109-112 (2009).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).
