Primer Nöronlarda Proteinlerin ve Sinaptik Belirteçlerin Eş Lokalizasyonunun İncelenmesinde Süper Çözünürlüklü Görüntüleme
Summary
Bu protokol, primer nöronal kültürlerde protein ko-lokalizasyonunu incelemek için süper çözünürlüklü mikroskopinin nasıl yapılacağını göstermektedir.
Abstract
Sinapslar nöronların fonksiyonel elemanları dır ve bunların kusurları veya kayıpları çeşitli nörodejeneratif ve nörolojik bozuklukların temelinde dir. Görüntüleme çalışmaları fizyolojik ve patolojik koşullarda işlevlerini ve plastisitesini araştırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Büyüklükleri ve yapıları nedeniyle proteinlerin lokalizasyon çalışmaları yüksek çözünürlüklü görüntüleme teknikleri gerektirir. Bu protokolde, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) kullanılarak süper çözünürlük düzeyinde sinaptik belirteçlerle hedef proteinlerin birlikte lokalizasyonu nun primer nöronlarda incelenmesi için bir prosedür tanımlıyoruz. SIM, geniş alan mikroskopisinin uzamsal çözünürlüğünü iki katına çıkararak yaklaşık 100 nm’lik bir detaya ulaşan desenli ışık aydınlatma tekniğidir. Protokol, sağlam eş yerelleştirme çalışmaları için gerekli denetimleri ve ayarları ve görüntüleme verilerini doğru analiz etmek için istatistiksel yöntemlere genel bakışı gösterir.
Introduction
Anlayış ve sinaps görünümü 18971Yılında Foster ve Sherrington tarafından ilk açıklamasından bu yana büyük ölçüde değişti. O zamandan beri, nöronal iletişim bilgimiz ve arkasındaki moleküler süreçler katlanarak 2büyüdü. Bu sinapslar iki bölmeli bir sistem olarak düşünülebilir açık hale gelmiştir: nörotransmitterlerin salınımı için veziküller içeren bir pre-sinaptik bölmesi ve reseptörleri ile post-sinaptik bölmesi3. Bu basit görüş, son yirmi yıl içinde, sinyalizasyon 4içine bağlayıcı transduce için gerekli proteinlerin karmaşık bir ağ haline gelmiştir.
Anlayış kazanımları kısmen sinapsların boyutuna uygun geleneksel ışık mikroskobu kırınım sınırını aştı süper çözünürlük teknikleri nedeniyle daha iyi5,6,7,8,9,10. Kırınım sınırı nedeniyle, optik mikroskop yanal olarak 200 nm üzerinde bir çözünürlüğe ulaşamaz11,12. Bu sınırı atlamak için, farklı yaklaşımlar kullanılarak ve farklı alt kırınım sınır kararlarına ulaşan süper çözünürlük teknikleri oluşturuldu: SIM, STED (Uyarılmış Emisyon Tükenmesi Mikroskopisi), PALM (FotoAktislokalizasyon Mikroskopisi) ve STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)13,14. SIM uyarma ışını yolu15içine bir kırınım ızgara ekleyerek lazer tabanlı geniş alan mikroskobu sistemlerinin mekansal çözünürlüğü iki katına çıkar. Hareketli ızgara, lazer ışınlarını difüzörlererek bilinen bir aydınlatma deseni oluşturur, genellikle çizgiler. Bu amaçla yapılandırılmış ışık deseni floresan boyanın (numunenin) bilinmeyen mekansal dağılımına yerleştirilir. İki modelin oluşturduğu girişim saçaklar, normal geniş alan mikroskobu yla ayırt edilemeyen ince ayrıntıları kodlar. Son süper çözümlü görüntü, kırınım ızgarasının çevirileri ve rotasyonları ile elde edilen aynı örneğin birkaç ham görüntüsünün matematiksel yöntemlerle birleştirilmesi ve kodlanması ile elde edilir. Süper çözülmüş görüntülerin çözünürlüğü lateral de 100 nm ve eksenel yönlerde 500 nm’ye ulaşır 2D-SIM15 veya 100 nm lateral de xeksensel yönlerde 3D-SIM16.
Sinaps yeni anlayış sinaptik disfonksiyon başlangıçlı ve ilerleme önemli bir rol oynar birçok nörolojik bozukluklar ışığında daha da önemlidir17,18. Alzheimer hastalığı, Down sendromu, Parkinson hastalığı, prion hastalıkları, epilepsi, otizm spektrum bozuklukları ve diğerleri arasında kırılgan X sendromu sinaptik kompozisyon anormallikleri ile bağlantılı olmuştur, morfoloji ve fonksiyon19,20,21,22.
Son zamanlarda, SUMO özgü antikorlar bir dizi kullanarak, biz süper çözünürlük düzeyinde pre-ve post-sinaptik belirteçleri sinapofiz ve PSD95 ile SUMO proteinlerinin primer hipokampal nöronlarda co-lokalizasyon göstermek için SIM kullanılır23. Bu, nöronlarda SUMO lokalizasyonuna dair biyokimyasal ve konfokal mikroskopi kanıtlarını doğrulamamızı sağladı.
Burada, fare hipokampal primer nöronlarda proteinlerin lokalizasyonunu inceleyen bir protokol uyguluyoruz. Aynı zamanda, bu protokol birincil nöronal kültürlerin farklı adapte edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sinapsın yapısını ve bileşimini açıklamak, hafıza ve bilişi düzenleyen fizyolojik ve patolojik süreçlerin anlaşılması için çok önemlidir. Normal durumda iken, sinapsbellek yapı taşları dır, onlar da Alzheimer hastalığı gibi karmaşık nörolojik bozukluklar altında yatan32. Burada açıklanan protokol sim adı verilen bir süper çözünürlüklü mikroskopi tekniği ile nöronal proteinlerin birlikte lokalizasyonu çalışma için hizmet vermektedir. Sim, belirli bir ayd…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar edoardo Micotti’ye el yazmasına yönelik yapıcı eleştirileri için teşekkür etmek isterler. Bu çalışma BrightFocus A2019296F, Fondo di Beneficenza – Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), Fondazione Regionale by la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) ve Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network (JK) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Chemical |
| 70 µm filter | Corning | 352350 | Equiment |
| Alexa | Thermo Fisher Scientific | – | Antibody |
| Antibody SENP1 | Santa Cruz | sc-271360 | Antibody |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Chemical |
| Bovine serum albumin | Merck | 5470 | Chemical |
| CaCl2 | Merck Life Science | 21115 | Chemical |
| Chambered coverslips | Ibidi | 80826 | Equiment |
| DyLight | Thermo Fisher Scientific | – | Antibody |
| FBS (Hyclone) | GIBCO | SH3007002 (CHA1111L) | Serum |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow–green fluorescent | Thermo Fisher Scientific | F8803 | Equiment |
| Glucose | Merck Life Science | G8769 | Chemical |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | Chemical |
| HEPES | Merck Life Science | H3537 | Chemical |
| L-Cystein | Merck Life Science | C6852-25g | Chemical |
| MAP2 | Merck | AB15452 | Antibody |
| MEM | Life Technologies | 21575022 | Medium |
| MgCl | Merck Life Science | M8266 | Chemical |
| NaOH | VWR International | 1,091,371,000 | Chemical |
| Neurobasal A | Life Technologies | 10888022 | Medium |
| N-SIM Super Resolution Microscope | Nikon | – | Instrument |
| Papain | Merck Life Science | P-3125 | Chemical |
| paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Chemical |
| Pen/Strep 10x | Life Technologies | 15140122 | Chemical |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Chemical |
| Poly-L lysine | Sigma | P2636 | Chemical |
| ProLong Diamond Glass Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Chemical |
| PSD95 | NeuroMab | K28/43 | Antibody |
| Round coverglass | Thermo | 12052712 | Equiment |
| SUMO1 | Abcam | ab32058 | Antibody |
| Synaptophysin | Merck | S5768 | Antibody |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | Chemical |
| Trypsin inhibitor | Merck Life Science | T9003-500MG | Chemical |
Riferimenti
- Foster, M., Sherrington, C. S. . A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.). , (1897).
- Choquet, D., Triller, A. The Dynamic Synapse. Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).
- McAllister, A. K. Dynamic Aspects of CNS Synapse Formation. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 425-450 (2007).
- Yuzaki, M. Two Classes of Secreted Synaptic Organizers in the Central Nervous System. Annual Review of Physiology. 80 (1), 243-262 (2018).
- Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
- Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
- Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).
- Badawi, Y., Nishimune, H. Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses. Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).
- Scalisi, S., Barberis, A., Petrini, E. M., Zanacchi, F. C., Diaspro, A. Unveiling the Inhibitory Synapse Organization Using Superresolution Microscopy. Biophysical Journal. 116 (3), 133 (2019).
- Yang, X., Specht, C. G. Subsynaptic Domains in Super-Resolution Microscopy: The Treachery of Images. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, (2019).
- Monro, T. Beyond the diffraction limit. Nature Photonics. 3 (7), 361 (2009).
- Won, R. Eyes on super-resolution. Nature Photonics. 3 (7), 368-369 (2009).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6 (1), 27290 (2016).
- Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Brose, N., O’Connor, V., Skehel, P. Synaptopathy: dysfunction of synaptic function. Biochemical Society Transactions. 38 (2), 443-444 (2010).
- Tyebji, S., Hannan, A. J. Synaptopathic mechanisms of neurodegeneration and dementia: Insights from Huntington’s disease. Progress in Neurobiology. 153, 18-45 (2017).
- Won, H., Mah, W., Kim, E. Autism spectrum disorder causes, mechanisms, and treatments: focus on neuronal synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, (2013).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. The State of Synapses in Fragile X Syndrome. The Neuroscientist. 15 (5), 549-567 (2009).
- Pavlowsky, A., Chelly, J., Billuart, P. Emerging major synaptic signaling pathways involved in intellectual disability. Molecular Psychiatry. 17 (7), 682-693 (2012).
- Senatore, A., Restelli, E., Chiesa, R. Synaptic dysfunction in prion diseases: a trafficking problem. International Journal of Cell Biology. 2013, 543803 (2013).
- Colnaghi, L., et al. Super Resolution Microscopy of SUMO Proteins in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Müller, M., Mönkemöller, V., Hennig, S., Hübner, W., Huser, T. Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ. Nature Communications. 7 (1), 10980 (2016).
- Ball, G., et al. SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy. Scientific Reports. 5 (1), 15915 (2015).
- Schaefer, L. H., Schuster, D., Schaffer, J. Structured illumination microscopy: artefact analysis and reduction utilizing a parameter optimization approach. Journal of Microscopy. 216 (2), 165-174 (2004).
- Culley, S., et al. NanoJ-SQUIRREL: quantitative mapping and minimisation of super-resolution optical imaging artefacts. Nature Methods. 15 (4), 263-266 (2018).
- Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. Measurement of co-localization of objects in dual-colour confocal images. Journal of Microscopy. 169 (3), 375-382 (1993).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224, 213-232 (2006).
- Bae, J. R., Kim, S. H. Synapses in neurodegenerative diseases. BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).
- Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. Super-resolution Microscopy Approaches for Live Cell Imaging. Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Karras, C., et al. Successful optimization of reconstruction parameters in structured illumination microscopy – A practical guide. Optics Communications. 436, 69-75 (2019).
- Bereczki, E., et al. Synaptic markers of cognitive decline in neurodegenerative diseases: a proteomic approach. Brain: A Journal of Neurology. 141 (2), 582-595 (2018).
- Gilestro, G. F., Tononi, G., Cirelli, C. Widespread Changes in Synaptic Markers as a Function of Sleep and Wakefulness in Drosophila. Science. 324 (5923), 109-112 (2009).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).
