تقييم المشاركة المستهدفة الخلوية من قبل SHP2 (PTPN11) مثبطات Phosphatase
Summary
إن القدرة على تقييم المشاركة المستهدفة من قبل مثبطات المرشح في الخلايا السليمة أمر بالغ الأهمية لاكتشاف المخدرات. يصف هذا البروتوكول 384 شكل جيد فحص التحول الحراري الخلوي الذي يكشف بشكل موثوق الاشتباك الهدف الخلوي من مثبطات تستهدف إما البرية من نوع SHP2 أو المتغيرات oncogenic لها.
Abstract
وSrc-homology 2 (SH2) المجال التي تحتوي على phosphatase 2 (SHP2), المشفرة من قبل PTPN11 بروتو-oncogene, هو وسيط رئيسي لمستقبلات التيروزين كيناز (RTK) يحركها خلية الإشارات, تعزيز بقاء الخلايا والانتشار. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تجنيد SHP2 من قبل مستقبلات نقطة الاختيار المناعية لمنع تنشيط الخلية B و T. وقد تورطت وظيفة SHP2 الشاذ في التنمية, التقدم, و الانبثاث من العديد من أنواع السرطان. في الواقع ، دخلت مثبطات SHP2 جزيء صغير مؤخرا التجارب السريرية لعلاج الأورام الصلبة مع تنشيط مسار راس / راف / ERK ، بما في ذلك الأورام مع بعض الطفرات رأس oncogenic. ومع ذلك، فإن الفئة الحالية من مثبطات SHP2 ليست فعالة ضد المتغيرات على اللوكوجينية SHP2 التي تحدث بشكل متكرر في اللوكيميا، وتطوير جزيئات صغيرة محددة تستهدف SHP2 oncogenic هو موضوع البحوث الحالية. وهناك مشكلة شائعة مع معظم حملات اكتشاف المخدرات التي تنطوي على البروتينات الخلوية مثل SHP2 هو أن المقايسات الأولية التي تدفع اكتشاف الكيميائية وغالبا ما تكون في المختبرات التي لا الإبلاغ عن الاشتباك الهدف الخلوي من المركبات المرشحة. لتوفير منصة لقياس الاشتباك الهدف الخلوية، قمنا بتطوير كل من نوع البرية ومتحول SHP2 المقايسات التحول الحراري الخلوي. هذه المقايسات تكشف بشكل موثوق الاشتباك الهدف من مثبطات SHP2 في الخلايا. هنا، ونحن نقدم بروتوكول شامل من هذا الفحص، الذي يوفر أداة قيمة لتقييم وتوصيف مثبطات SHP2.
Introduction
التيروزين الفسفر يلعب دورا هاما في نقل إشارة في الخلايا1،2. هذا التعديل ما بعد الترجمة هو تحفيزه من قبل كينازات التيروزين البروتين (PTKs) وعكسها من قبل فوسفاتاتات التيروزين البروتين (PTPs). لذلك ، فإن وظيفة PTK أو PTP الشاذة تؤدي إلى العديد من الأمراض البشرية الموروثة أو المكتسبة3و4و5و6. وSrc-homology 2 (SH2) المجال التي تحتوي على phosphatase 2 (SHP2) هو نوع غير مستقبلات أعرب عنها على نطاق واسع PTP PTP من قبل بروتو أونكوجين PTPN117 وهو المنظم الرئيسي للعديد من العمليات الفسيولوجية التي تنطوي على نقل إشارة عن طريق تفعيل راس / راف / ERK ، PI3K / AKT ، أو JAK / STAT إشارات المسارات8. عادة، يتم تنظيم نشاط SHP2 بإحكام من أجل منع الإشارات المنحرفة. تحت الظروف القاعدية SHP2 هو autoinhied من قبل المجال N- المحطة الطرفية SH2، الذي يمنع الوصول إلى الموقع النشط ضمن المجال الفوسفاتيز الحفاز (الشكل 1A)9،10. عند تنشيط الخلية، تقوم بروتينات الربط الفوسفورية التيروزين بتجنيد SHP2، مما يؤدي إلى اعتماد تركيبها النشط، حيث يمكن الوصول إلى الموقع النشط الآن إلى ركائزه. في العديد من أنواع السرطان SHP2 النشاط مرتفع. وقد تم تحديد الطفرات الجسدية كسب من وظيفة (GOF) في PTPN11 أساسا في اللوكيميا ومنع ربط المجال N-SH2 إلى المجال فوسفاتاتيز، مما أدى إلى SHP2 نشط بشكل تأسيسي (الشكل 1B)11. الطفرات GERMLINE GOF في PTPN11 هي المسؤولة عن ~ 50٪ من حالات متلازمة نونان, اضطراب النمو مع زيادة خطر الإصابة بالخطورة12. في الأورام الصلبة، حيث الطفرات PTPN11 نادرة، مستويات أكبر من البروتينات ملزمة الفوسفورية تؤدي إلى تعزيز نشاط SHP2(الشكل 1C). SHP2 مهم أيضا للإشارة نقطة تفتيش المناعة، كما مستقبلات نقطة تفتيش مثل BTLA أو PD-1 تجنيد SHP2 لجزيئات الإشارات الرئيسية ديفوسفوريلا، ومنع تنشيط الخلايا المناعية13،14،15.
وقد كان استهداف PTPs مع جزيئات صغيرة تحديا، وذلك لأن الموقع النشط من PTPs هو الحفاظ على درجة عالية من مشحونة؛ مثبطات التي تستهدف الموقع النشط غالبا ما تكون قوية، ولكن تظهر الانتقائية الفقراء والتوافر البيولوجي عن طريق الفم16،17،18،19،20،21،22. في الواقع، العديد من المثبطات SHP2 ذكرت تعاني من ضعف الانتقائية وعدم الفعالية في الخلايا23. في الآونة الأخيرة، تم الإبلاغ عن مثبطات اللويسترية من SHP2 مع قوة جيدة وانتقائية ممتازة (على سبيل المثال، SHP09924 و RMC-455025) وأثارت اهتماما متجددا في مثبطات SHP2. المركبات على أساس SHP099 و RMC-4550 حاليا في المرحلة الأولى التجارب السريرية لعلاج الأورام الصلبة مع مستقبلات كيناز التيروزين (RTK) تفعيل المسار26,27. في حين وضع حجر الأساس، هذه المركبات غير فعالة ضد العديد من المسوخ SHP2 oncogenic التي تدفع تولد الكرية في عدد كبير من مرضى سرطان الدم28،29،30. هذا النقص في قوة المركبات الشبيهة بـ SHP099 نحو المتغيرات SHP2 oncogenic ينبع من آلية التليسية الفريدة ، لأنها تمنع نشاط SHP2 عن طريق الربط وتثبيت التشكل غير النشط والمغلق ، والذي يتم تعطيله في المسوخ SHP2. علاوة على ذلك, استنادا إلى تقرير31مؤخرا , آليات المقاومة التكيفية في المرضى الذين عولجوا مع مثبطات مثل SHP099 يمكن تصورها تماما. وبالتالي، فإن تطوير الجيل القادم من مثبطات SHP2 التي تستهدف حالته النشطة والمفتوحة هو موضوع بحث مكثف.
توصيف مثبطات SHP2 رواية في الخلايا هو جانب أساسي من عملية تحسين الرصاص. بشكل حاسم، ثبت المشاركة المستهدفة من المانع في ظل الظروف الفسيولوجية يوفر مستوى إضافي من الثقة التي يتم نشرها بكفاءة الموارد للكيمياء الطبية على المركبات مع الكفاءة الخلوية الواعدة. في الماضي، تم تطوير عدة طرق لتقييم ربط مثبطات الجزيئات الصغيرة لأهدافها، في المقام الأول بالنسبة للبروتينكيناز 32. لتطوير SHP2 الخلية الهدف الاشتباك المقايسة، استخدمنا الخلوية التحول الحراريالمقايسة 33. هذا الفحص، على غرار التحول الحراري في المختبر (PTS) للبروتينات34، يراقب الاستقرار الحراري البروتيني المستهدف ، والذي عادة ما يتم تغييره من خلال ربط الجزيئات الصغيرة. المقايسة الأصلية هي تحليل منخفض الإنتاجية يستخدم الأجسام المضادة لتحديد مستويات البروتين المستهدفة. بدلا من ذلك، اخترنا البديل ذكرت مؤخرا من تحليل التحول الحراري الذي يستخدم β-galactosidase إنزيم تكملة جزء (EFC) مقايسة(الشكل 2)35. لهذه التجارب، يتم التعبير عن البروتين من الفائدة في الخلايا كبروتين الانصهار N- أو C-المحطة الطرفية تحمل علامة ProLabel المحسنة (ePL، وهو جزء من الأحماض الأمينية 42 من β-galactosidase). ثم يتم نقل الخلايا إلى 384 جيدا لوحات متوافقة PCR ومحتضنة مع المركبات ذات الفائدة. ويستخدم الدراجات الحرارية لتطبيق تدرج درجة الحرارة على الخلايا، التي البروتينات سوف التكهد والتجميع كما يزيد درجة الحرارة على أساس استقرارها الحراري. إن قدرة المركب المرشح على ربط البروتين الذي يهمه وتثبيته سيؤدي إلى زيادة الاستقرار الحراري لهذا البروتين. لذلك ، بعد تحلل الخلايا ، ستظل البروتينات الموسومة التي استقرت من قبل مركب مرشح في الحل في درجات حرارة أعلى من بروتينات الخلايا الموسومة من الخلايا المحتضنة مع التحكم في السيارة. مراسل إنزيم acceptor (EA) قادر على استكمال البروتينات ذات العلامات ePL القابلة للذوبان ، مما يؤدي إلى نشاط β -galactosidase قابل للكشف باستخدام ركيزة الإنارة.
لقد طورنا مؤخرًا مقايسة حرارية خلوية قوية لـ SHP2 من النوع البري (SHP2-WT) ومتغير SHP2 oncogenic المتكرر (SHP2-E76K) فيتنسيق384-well مصغر. هنا، نحن الإبلاغ عن بروتوكول مفصل من هذا الفحص، الذي يكشف بشكل موثوق الاشتباك المستهدف من قبل مثبطات SHP2 في الخلايا ويظهر درجة عالية من الارتباط بين قوة المانع وبيانات التحول الحراري الخلوي. ويتضح سير العمل في الحسبة العامة في الشكل 3. تستخدم منصتنا بروتينات الاندماج ePL-SHP2 ذات الطول الكامل EPL-SHP2. للحصول على توليد pICP-ePL-N-SHP2-WT وpICP-ePL-N-SHP2-E76K التعبير، يرجى الرجوع إلى نشرنا الأخيرة36. ويمكن إجراء هذا الفحص باستخدام التدرج الحراري لإنشاء SHP2 الملامح الحرارية وتحديد SHP2 ذوبان درجات الحرارة في وجود أو عدم وجود المانع. وبمجرد تحديد الملامح الحرارية، يمكن أيضاً تنفيذها في ظل ظروف متساوية، مما يسمح بتقييم استجابة الجرعة المانعة. ويرد أدناه وصف لكلا النوعين من التجارب.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد قدمنا فحص الاشتباك الهدف التي يمكن أن تؤكد الربط المباشر للجزيئات الصغيرة إلى phosphatase SHP2 في الخلايا. يمكن أن تميز المقايسة بين مثبطات التقارب المنخفضة والعالية ، والأهم من ذلك ، تؤكد عدم فاعلية مثبطات اللوسترية من نوع SHP099 لـ GOF oncogenic SHP2-E76K. قوة هذا المقايسة المصغرة هي قدرتها على الاندماج …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة 1R21CA195422 (ل. T.) ، وجائزة مؤسسة إبشتاين الأسرة (إلى N. D. P.C.) ، ومركز NCI دعم مركز P30CA030199. وبالإضافة إلى ذلك، تم تمويل هذا المشروع كليا أو جزئيا بأموال اتحادية من المعهد الوطني للسرطان، والمعاهد الوطنية للصحة، بموجب عقد اتحاد البيولوجيا الكيميائية رقم 1. HHSN261200800001E. لا يعكس محتوى هذا المنشور بالضرورة آراء أو سياسات وزارة الصحة والخدمات الإنسانية، ولا يتضمن ذكر الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية أو المنظمات تأييدًا من قبل حكومة الولايات المتحدة. والمحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحده ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| 384-well gradient equipped thermocycler | Eppendorf AG | X50h | |
| 384-well low dead volume microplate Echo qualified | Beckman Coulter, Inc. | LP-0200 | |
| 6-well cell culture plates | Greiner Bio-One | 657 160 | Sterile with lid |
| Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X | Thermo Fisher Scientific | 15240-062 | |
| Cell counter | Thermo Fisher Scientific | Countess II FL | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 10566-016 | 500 mL |
| Echo acoustic liquid handler | Beckman Coulter, Inc. | Echo 550 | |
| Electronic multichannel pipette | Thermo Fisher Scientific | E1 ClipTip | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140-079 | 500 mL |
| HEPES buffer | Thermo Fisher Scientific | 15630-680 | 100 mL |
| InCell Pulse starter kit | Eurofins DiscoverX Corp. | 94-4007 | Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate |
| Microplate reader | Tecan Trading AG | Spark | |
| Single channel solution trough | Thermo Fisher Scientific | S253012005 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-010 | 100 mM |
| Thermal microplate sealer | Agilent Technologies, Inc. | PlateLoc | |
| Transfection reagents | Polyplus Transfection | jetPRIME | |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| TrypLE Express reagent | Thermo Fisher Scientific | 12605-010 | |
| Twin.tec 384 real-time PCR plates | Eppendorf AG | 30132734 |
Riferimenti
- Hunter, T. Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting. Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).
- Alonso, A., et al. Protein tyrosine phosphatases in the human genome. Cell. 117 (6), 699-711 (2004).
- Cohen, P. Protein kinases-the major drug targets of the twenty-first century. Nature Reviews Drug Discovery. 1 (4), 309 (2002).
- Ferguson, F. M., Gray, N. S. Kinase inhibitors: the road ahead. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (5), 353-377 (2018).
- Stanford, S. M., Bottini, N. Targeting Tyrosine Phosphatases: Time to End the Stigma. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (6), 524-540 (2017).
- Tonks, N. Protein tyrosine phosphatases–from housekeeping enzymes to master regulators of signal transduction. FEBS Journal. 280 (2), 346-378 (2013).
- Chan, R., Feng, G. PTPN11 is the first identified proto-oncogene that encodes a tyrosine phosphatase. Blood. 109 (3), 862-867 (2007).
- Chan, G., Kalaitzidis, D., Neel, B. The tyrosine phosphatase Shp2 (PTPN11) in cancer. Cancer Metastasis Rev. 27 (2), 179-192 (2008).
- Hof, P., Pluskey, S., Dhe-Paganon, S., Eck, M., Shoelson, S. Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2. Cell. 92 (4), 441-450 (1998).
- Barford, D., Neel, B. Revealing mechanisms for SH2 domain mediated regulation of the protein tyrosine phosphatase SHP-2. Structure. 6 (3), 249-254 (1998).
- Neel, B. G., Chan, G., Dhanji, S. . Handbook of Cell Signaling (Second Edition). 2, 771-809 (2010).
- Tartaglia, M., et al. Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome. Nature Genetics. 29 (4), 465-468 (2001).
- Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
- Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (24), 13866-13871 (2001).
- Watanabe, N., et al. BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA-4 and PD-1. Nature Immunology. 4 (7), 670-679 (2003).
- Bialy, L., Waldmann, H. Inhibitors of protein tyrosine phosphatases: next-generation drugs. Angewandte Chemie International Edition England. 44 (25), 3814-3839 (2005).
- Kumar, S., Liang, F., Lawrence, D., Zhang, Z. Small molecule approach to studying protein tyrosine phosphatase. Methods. 35 (1), 9-21 (2005).
- Tautz, L., Pellecchia, M., Mustelin, T. Targeting the PTPome in human disease. Expert Opinion in Thereapeutics Targets. 10 (1), 157-177 (2006).
- Tautz, L., Mustelin, T. Strategies for developing protein tyrosine phosphatase inhibitors. Methods. 42 (3), 250-260 (2007).
- Vintonyak, V., Antonchick, A., Rauh, D., Waldmann, H. The therapeutic potential of phosphatase inhibitors. Current Opinion in Chemical Biology. 13 (3), 272-283 (2009).
- Barr, A. Protein tyrosine phosphatases as drug targets: strategies and challenges of inhibitor development. Future Medicinal Chemistry. 2 (10), 1563-1576 (2010).
- He, R., Zeng, L., He, Y., Zhang, S., Zhang, Z. Small molecule tools for functional interrogation of protein tyrosine phosphatases. FEBS Journal. 280, 731-750 (2012).
- Tsutsumi, R., Ran, H., Neel, B. G. Off-target inhibition by active site-targeting SHP2 inhibitors. FEBS Open Biology. 8 (9), 1405-1411 (2018).
- Chen, Y. N., et al. Allosteric inhibition of SHP2 phosphatase inhibits cancers driven by receptor tyrosine kinases. Nature. 535 (7610), 148-152 (2016).
- Nichols, R. J., et al. RAS nucleotide cycling underlies the SHP2 phosphatase dependence of mutant BRAF-, NF1- and RAS-driven cancers. Nature Cell Biology. 20 (9), 1064-1073 (2018).
- . Clinical Trial NCT03114319 Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1 (2019)
- . Clinical Trial NCT03634982 Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1 (2019)
- Sun, X., et al. Selective inhibition of leukemia-associated SHP2(E69K) mutant by the allosteric SHP2 inhibitor SHP099. Leukemia. 32 (5), 1246-1249 (2018).
- LaRochelle, J. R., et al. Structural reorganization of SHP2 by oncogenic mutations and implications for oncoprotein resistance to allosteric inhibition. Nature Communication. 9 (1), 4508 (2018).
- Padua, R. A. P., et al. Mechanism of activating mutations and allosteric drug inhibition of the phosphatase SHP2. Nature Communication. 9 (1), 4507 (2018).
- Lu, H., et al. Resistance to allosteric SHP2 inhibition in FGFR-driven cancers through rapid feedback activation of FGFR. Oncotarget. 11 (3), 265-281 (2020).
- Smyth, L. A., Collins, I. Measuring and interpreting the selectivity of protein kinase inhibitors. Journal of Chemical Biology. 2 (3), 131-151 (2009).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Ericsson, U., Hallberg, B., Detitta, G., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
- McNulty, D. E., et al. A High-Throughput Dose-Response Cellular Thermal Shift Assay for Rapid Screening of Drug Target Engagement in Living Cells, Exemplified Using SMYD3 and IDO1. SLAS Discovery. 23 (1), 34-46 (2018).
- Romero, C., et al. A cellular target engagement assay for the characterization of SHP2 (PTPN11) phosphatase inhibitors. Journal of Biological Chemistry. 295 (9), 2601-2613 (2020).
- Ran, H., Tsutsumi, R., Araki, T., Neel, B. G. Sticking It to Cancer with Molecular Glue for SHP2. Cancer Cell. 30 (2), 194-196 (2016).
