Beoordeling van Cellular Target Engagement door SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors
Summary
De mogelijkheid om doelbetrokkenheid door kandidaat-remmers in intacte cellen te beoordelen is cruciaal voor de ontdekking van geneesmiddelen. Dit protocol beschrijft een 384 goed formaat cellulaire thermische verschuiving test die betrouwbaar detecteert cellulaire doel betrokkenheid van remmers gericht op ofwel wild-type SHP2 of de oncogene varianten.
Abstract
De Src-homologie 2 (SH2) domein-bevattende fosfatase 2 (SHP2), gecodeerd door de PTPN11 proto-oncogeen, is een belangrijke bemiddelaar van receptor tyrosine kinase (RTK)-gedreven cel signalering, het bevorderen van celoverleving en proliferatie. Daarnaast wordt SHP2 aangeworven door immuuncontrolepuntreceptoren om de activering van B- en T-cellen te remmen. Afwijkende SHP2 functie is betrokken bij de ontwikkeling, progressie, en metastase van vele vormen van kanker. Inderdaad, kleine molecuul SHP2 remmers zijn onlangs opgenomen klinische proeven voor de behandeling van vaste tumoren met Ras / Raf / ERK route activering, met inbegrip van tumoren met een aantal oncogene Ras mutaties. Echter, de huidige klasse van SHP2 remmers is niet effectief tegen de SHP2 oncogene varianten die vaak voorkomen in leukemie, en de ontwikkeling van specifieke kleine moleculen die zich richten op oncogene SHP2 is het onderwerp van het huidige onderzoek. Een veel voorkomend probleem met de meeste drug discovery campagnes waarbij cytosolische eiwitten zoals SHP2 is dat de primaire tests die chemische ontdekking rijden zijn vaak in vitro testen die niet de cellulaire doel betrokkenheid van kandidaat-verbindingen verslag. Om een platform te bieden voor het meten van cellulaire doelbetrokkenheid, ontwikkelden we zowel wild-type als mutant SHP2 cellulaire thermische verschuivingstesten. Deze tests detecteren betrouwbaar doel betrokkenheid van SHP2 remmers in cellen. Hier bieden we een uitgebreid protocol van deze test, die een waardevol instrument biedt voor de beoordeling en karakterisering van SHP2-remmers.
Introduction
Tyrosine fosforylatie speelt een belangrijke rol bij signaaltransductie in cellen1,2. Deze post-translationele modificatie wordt gekatalyseerd door eiwit tyrosine kinases (PTK’s) en omgekeerd door eiwit tyrosine fosfatases (PTPs). Daarom leidt de afwijkende PTK- of PTP-functie tot veel erfelijke of verworven menselijke ziekten3,4,5,6. De Src-homologie 2 (SH2) domein-bevattende fosfatase 2 (SHP2) is een breed uitgedrukte niet-receptor type PTP gecodeerd door de proto-oncogene PTPN117 en is een belangrijke regulator van tal van fysiologische processen die signaal transductie te betrekken door activering van de Ras / Raf / ERK, PI3K / Akt, of JAK / STAT signalering trajecten8. Normaal gesproken is SHP2-activiteit strak geregeld om afwijkende signalering te voorkomen. Onder basale omstandigheden wordt SHP2 autoinhibited door zijn N-terminal SH2-domein, dat de toegang tot de actieve site binnen het katalytische fosfatasedomein blokkeert (figuur 1A)9,10. Bij celactivering rekruteren tyrosine fosforylated bindende eiwitten SHP2, waardoor het zijn actieve conformatie overneemt, waarbij de actieve site nu toegankelijk is voor zijn substraten. Bij veel vormen van kanker is de SHP2-activiteit verhoogd. Somatische gain-of-function (GOF) mutaties in PTPN11 zijn vooral geïdentificeerd in leukemie en voorkomen dat het N-SH2-domein wordt verbonden aan het fosfatasedomein, wat resulteert in constitutief actieve SHP2 (figuur 1B)11. Germline GOF mutaties in PTPN11 zijn verantwoordelijk voor ~50% van de gevallen van het Noonan syndroom, een ontwikkelingsstoornis met een verhoogd risico op maligniteit12. Bij vaste tumoren, waar PTPN11 mutaties zeldzaam zijn, leiden grotere niveaus van fosforgeyleerde bindende eiwitten tot verbeterde SHP2-activiteit(figuur 1C). SHP2 is ook belangrijk voor immuun checkpoint signalering, als checkpoint receptoren zoals BTLA of PD-1 werven SHP2 om key signaling moleculen dephosphorylaat dephosphorylaat dephosphorylaat, het voorkomen van immuuncel activering13,14,15.
Het aanpakken van PTPs met kleine moleculen is een uitdaging geweest, omdat de actieve site van PTP’s zeer behouden en zeer geladen is; remmers die zich richten op de actieve site zijn vaak krachtig, maar vertonen een slechte selectiviteit en orale biologische beschikbaarheid16,17,18,19,20,21,22. Inderdaad, veel gemelde SHP2-remmers lijden aan slechte selectiviteit en gebrek aan werkzaamheid in cellen23. Onlangs zijn allosterische remmers van SHP2 met een goede potentie en uitstekende selectiviteit gemeld (bijvoorbeeld SHP09924 en RMC-455025) en hebben hernieuwde interesse gewekt in SHP2-remmers. Verbindingen op basis van SHP099 en RMC-4550 zijn momenteel in fase I klinische proeven voor de behandeling van vaste tumoren met receptor tyrosine kinase (RTK) route activering26,27. Hoewel baanbrekend, deze verbindingen zijn niet effectief tegen veel van de SHP2 oncogene mutanten die leukemogenese rijden bij een aanzienlijk aantal bloedkanker patiënten28,29,30. Dit gebrek aan potentie van SHP099-achtige verbindingen in de richting van de SHP2 oncogene varianten komt voort uit hun unieke allosterische mechanisme, omdat ze de SHP2-activiteit remmen door de inactieve, gesloten conformatie te binden en te stabiliseren, die wordt verstoord in SHP2-mutanten. Verder, op basis van een recent rapport31, adaptieve weerstand mechanismen bij patiënten behandeld met SHP099-achtige remmers zijn heel denkbaar. Bijgevolg is de ontwikkeling van de volgende generatie SHP2-remmers die zich richten op zijn actieve, open staat een onderwerp van intensief onderzoek.
De karakterisering van nieuwe SHP2-remmers in cellen is een essentieel aspect van het leadoptimalisatieproces. Kritisch, bewezen doel betrokkenheid van de remmer onder fysiologische omstandigheden biedt een extra niveau van vertrouwen dat middelen voor medicinale chemie efficiënt worden ingezet op verbindingen met veelbelovende cellulaire werkzaamheid. In het verleden zijn verschillende methoden ontwikkeld om de binding van kleine molecuulremmers aan hun doelen te beoordelen, voornamelijk voor eiwitkinases32. Voor de ontwikkeling van een SHP2 cellulaire doel engagement test, gebruikten we een cellulaire thermische verschuiving test33. Deze test, vergelijkbaar met de in vitro thermal shift (PTS) test voor eiwitten34,bewaakt het doel eiwit thermische stabiliteit, die meestal wordt veranderd door de binding van kleine moleculen. De oorspronkelijke test is een lage doorvoertest die antilichamen gebruikt om doeleiwitniveaus te kwantificeren. Als alternatief hebben we gekozen voor een onlangs gerapporteerde variant van de thermische verschuivingstest die gebruik maakt van een β-galactosidase enzymfragmentcomplementatie (EFC) test(figuur 2)35. Voor deze experimenten wordt het eiwit van belang uitgedrukt in cellen als een N- of C-terminale fusie-eiwit met een verbeterde ProLabel-tag (ePL, een 42 aminozuurfragment van β-galactosidase). Cellen worden vervolgens overgebracht naar 384-well PCR compatibele platen en geïncubeerd met verbindingen van belang. Een thermocycler wordt gebruikt om een temperatuurgradiënt toe te passen op de cellen, waarvan de eiwitten zullen denatureren en aggregaat als de temperatuur stijgt op basis van hun thermische stabiliteit. Het vermogen van een kandidaat-verbinding om het eiwit van belang te binden en te stabiliseren zal resulteren in een verhoogde thermische stabiliteit van dat eiwit. Daarom, na de lysis van de cellen, zullen de gelabelde eiwitten die zijn gestabiliseerd door een kandidaat-verbinding in oplossing blijven bij hogere temperaturen dan gelabelde eiwitten van cellen die zijn geïncubeerd met voertuigcontrole. Reporter enzym acceptor (EA) is in staat om de oplosbare ePL-gelabelde eiwitten aan te vullen, wat resulteert in detecteerbare β-galactosidase activiteit met behulp van een luminescentie substraat.
We hebben onlangs een robuuste cellulaire thermische shift test ontwikkeld voor wild-type SHP2 (SHP2-WT) en een frequente SHP2 oncogenic variant (SHP2-E76K) in een geminiaturiseerde 384-well formaat36. Hier rapporteren we een gedetailleerd protocol van deze test, die op betrouwbare wijze detecteert doel betrokkenheid door SHP2-remmers in cellen en toont een hoge mate van correlatie tussen remmer potentie en cellulaire thermische verschuiving gegevens. De algemene testworkflow wordt geïllustreerd in figuur 3. Ons platform maakt gebruik van N-terminaal gelabelde full-length ePL-SHP2 fusion eiwitten. Voor de generatie van de overeenkomstige pICP-ePL-N-SHP2-WT en pICP-ePL-N-SHP2-E76K expressie plasmids, verwijzen wij u naar onze recente publicatie36. Deze test kan worden uitgevoerd met behulp van een thermische gradiënt om SHP2 thermische profielen vast te stellen en SHP2 smelttemperaturen te bepalen in de aanwezigheid of afwezigheid van remmer. Zodra thermische profielen zijn vastgesteld, kan het ook worden uitgevoerd onder isothermale omstandigheden, waardoor remmer dosis-respons beoordeling. Beide soorten experimenten worden hieronder beschreven.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben een doel betrokkenheid test die kan bevestigen directe binding van kleine moleculen aan de SHP2 fosfor in cellen. De test kan onderscheid maken tussen lage en hoge affiniteitsremmers en, belangrijker nog, een gebrek aan potentie bevestigen door de allosterische remmers van het SHP099-type voor de GOF oncogeen SHP2-E76K mutant. Een kracht van deze geminiaturiseerde test is het vermogen om te worden geïntegreerd in een SHP2 remmer screening campagne. Het vermogen van de test om intracellulaire binding aan SHP2 t…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health Grant 1R21CA195422 (aan L.T.), Epstein Family Foundation Award (aan N.D.P.C.), en NCI Cancer Center Support Grant P30CA030199. Bovendien is dit project geheel of gedeeltelijk gefinancierd met federale fondsen van het National Cancer Institute, National Institutes of Health, onder Chemical Biology Consortium Contract No. HHSN261200800001E. De inhoud van deze publicatie weerspiegelt niet noodzakelijkerwijs de standpunten of het beleid van het Ministerie van Volksgezondheid en Human Services, noch vermeldt het van handelsnamen, commerciële producten, of organisaties goedkeuring door de Overheid van de V.S. impliceert. De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.
Materials
| 384-well gradient equipped thermocycler | Eppendorf AG | X50h | |
| 384-well low dead volume microplate Echo qualified | Beckman Coulter, Inc. | LP-0200 | |
| 6-well cell culture plates | Greiner Bio-One | 657 160 | Sterile with lid |
| Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X | Thermo Fisher Scientific | 15240-062 | |
| Cell counter | Thermo Fisher Scientific | Countess II FL | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 10566-016 | 500 mL |
| Echo acoustic liquid handler | Beckman Coulter, Inc. | Echo 550 | |
| Electronic multichannel pipette | Thermo Fisher Scientific | E1 ClipTip | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140-079 | 500 mL |
| HEPES buffer | Thermo Fisher Scientific | 15630-680 | 100 mL |
| InCell Pulse starter kit | Eurofins DiscoverX Corp. | 94-4007 | Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate |
| Microplate reader | Tecan Trading AG | Spark | |
| Single channel solution trough | Thermo Fisher Scientific | S253012005 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-010 | 100 mM |
| Thermal microplate sealer | Agilent Technologies, Inc. | PlateLoc | |
| Transfection reagents | Polyplus Transfection | jetPRIME | |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| TrypLE Express reagent | Thermo Fisher Scientific | 12605-010 | |
| Twin.tec 384 real-time PCR plates | Eppendorf AG | 30132734 |
Riferimenti
- Hunter, T. Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting. Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).
- Alonso, A., et al. Protein tyrosine phosphatases in the human genome. Cell. 117 (6), 699-711 (2004).
- Cohen, P. Protein kinases-the major drug targets of the twenty-first century. Nature Reviews Drug Discovery. 1 (4), 309 (2002).
- Ferguson, F. M., Gray, N. S. Kinase inhibitors: the road ahead. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (5), 353-377 (2018).
- Stanford, S. M., Bottini, N. Targeting Tyrosine Phosphatases: Time to End the Stigma. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (6), 524-540 (2017).
- Tonks, N. Protein tyrosine phosphatases–from housekeeping enzymes to master regulators of signal transduction. FEBS Journal. 280 (2), 346-378 (2013).
- Chan, R., Feng, G. PTPN11 is the first identified proto-oncogene that encodes a tyrosine phosphatase. Blood. 109 (3), 862-867 (2007).
- Chan, G., Kalaitzidis, D., Neel, B. The tyrosine phosphatase Shp2 (PTPN11) in cancer. Cancer Metastasis Rev. 27 (2), 179-192 (2008).
- Hof, P., Pluskey, S., Dhe-Paganon, S., Eck, M., Shoelson, S. Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2. Cell. 92 (4), 441-450 (1998).
- Barford, D., Neel, B. Revealing mechanisms for SH2 domain mediated regulation of the protein tyrosine phosphatase SHP-2. Structure. 6 (3), 249-254 (1998).
- Neel, B. G., Chan, G., Dhanji, S. . Handbook of Cell Signaling (Second Edition). 2, 771-809 (2010).
- Tartaglia, M., et al. Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome. Nature Genetics. 29 (4), 465-468 (2001).
- Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
- Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (24), 13866-13871 (2001).
- Watanabe, N., et al. BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA-4 and PD-1. Nature Immunology. 4 (7), 670-679 (2003).
- Bialy, L., Waldmann, H. Inhibitors of protein tyrosine phosphatases: next-generation drugs. Angewandte Chemie International Edition England. 44 (25), 3814-3839 (2005).
- Kumar, S., Liang, F., Lawrence, D., Zhang, Z. Small molecule approach to studying protein tyrosine phosphatase. Methods. 35 (1), 9-21 (2005).
- Tautz, L., Pellecchia, M., Mustelin, T. Targeting the PTPome in human disease. Expert Opinion in Thereapeutics Targets. 10 (1), 157-177 (2006).
- Tautz, L., Mustelin, T. Strategies for developing protein tyrosine phosphatase inhibitors. Methods. 42 (3), 250-260 (2007).
- Vintonyak, V., Antonchick, A., Rauh, D., Waldmann, H. The therapeutic potential of phosphatase inhibitors. Current Opinion in Chemical Biology. 13 (3), 272-283 (2009).
- Barr, A. Protein tyrosine phosphatases as drug targets: strategies and challenges of inhibitor development. Future Medicinal Chemistry. 2 (10), 1563-1576 (2010).
- He, R., Zeng, L., He, Y., Zhang, S., Zhang, Z. Small molecule tools for functional interrogation of protein tyrosine phosphatases. FEBS Journal. 280, 731-750 (2012).
- Tsutsumi, R., Ran, H., Neel, B. G. Off-target inhibition by active site-targeting SHP2 inhibitors. FEBS Open Biology. 8 (9), 1405-1411 (2018).
- Chen, Y. N., et al. Allosteric inhibition of SHP2 phosphatase inhibits cancers driven by receptor tyrosine kinases. Nature. 535 (7610), 148-152 (2016).
- Nichols, R. J., et al. RAS nucleotide cycling underlies the SHP2 phosphatase dependence of mutant BRAF-, NF1- and RAS-driven cancers. Nature Cell Biology. 20 (9), 1064-1073 (2018).
- . Clinical Trial NCT03114319 Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1 (2019)
- . Clinical Trial NCT03634982 Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1 (2019)
- Sun, X., et al. Selective inhibition of leukemia-associated SHP2(E69K) mutant by the allosteric SHP2 inhibitor SHP099. Leukemia. 32 (5), 1246-1249 (2018).
- LaRochelle, J. R., et al. Structural reorganization of SHP2 by oncogenic mutations and implications for oncoprotein resistance to allosteric inhibition. Nature Communication. 9 (1), 4508 (2018).
- Padua, R. A. P., et al. Mechanism of activating mutations and allosteric drug inhibition of the phosphatase SHP2. Nature Communication. 9 (1), 4507 (2018).
- Lu, H., et al. Resistance to allosteric SHP2 inhibition in FGFR-driven cancers through rapid feedback activation of FGFR. Oncotarget. 11 (3), 265-281 (2020).
- Smyth, L. A., Collins, I. Measuring and interpreting the selectivity of protein kinase inhibitors. Journal of Chemical Biology. 2 (3), 131-151 (2009).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Ericsson, U., Hallberg, B., Detitta, G., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
- McNulty, D. E., et al. A High-Throughput Dose-Response Cellular Thermal Shift Assay for Rapid Screening of Drug Target Engagement in Living Cells, Exemplified Using SMYD3 and IDO1. SLAS Discovery. 23 (1), 34-46 (2018).
- Romero, C., et al. A cellular target engagement assay for the characterization of SHP2 (PTPN11) phosphatase inhibitors. Journal of Biological Chemistry. 295 (9), 2601-2613 (2020).
- Ran, H., Tsutsumi, R., Araki, T., Neel, B. G. Sticking It to Cancer with Molecular Glue for SHP2. Cancer Cell. 30 (2), 194-196 (2016).
