Évaluation de l’engagement des cibles cellulaires par inhibiteurs de la phosphatase SHP2 (PTPN11)

Summary

La capacité d’évaluer l’engagement cible par les inhibiteurs candidats dans les cellules intactes est cruciale pour la découverte de médicaments. Ce protocole décrit un test de décalage thermique cellulaire de format 384 qui détecte de façon fiable l’engagement cellulaire des inhibiteurs ciblant soit le SHP2 de type sauvage, soit ses variantes oncogènes.

Abstract

Le domaine src-homologie 2 (SH2) contenant de la phosphatase 2 (SHP2), codé par le proto-oncogène PTPN11, est un médiateur clé de la signalisation cellulaire axée sur la tyrosine des récepteurs (RTK), favorisant la survie et la prolifération cellulaires. En outre, SHP2 est recruté par les récepteurs de point de contrôle immunitaire pour inhiber l’activation des cellules B et T. La fonction Aberrante de SHP2 a été impliquée dans le développement, la progression, et la métastase de beaucoup de cancers. En effet, de petits inhibiteurs de la molécule SHP2 ont récemment participé à des essais cliniques pour le traitement de tumeurs solides avec activation de la voie Ras/Raf/ERK, y compris des tumeurs avec quelques mutations oncogènes de Ras. Cependant, la classe actuelle des inhibiteurs de SHP2 n’est pas efficace contre les variantes oncogènes de SHP2 qui se produisent fréquemment dans les leucémies, et le développement de petites molécules spécifiques qui ciblent le SHP2 oncogène fait l’objet de recherches actuelles. Un problème commun avec la plupart des campagnes de découverte de drogue impliquant des protéines cytosoliques comme SHP2 est que les analyses primaires qui conduisent à la découverte chimique sont souvent des analyses in vitro qui ne signalent pas l’engagement cible cellulaire des composés candidats. Pour fournir une plate-forme pour mesurer l’engagement cellulaire de la cible, nous avons développé des analyses thermiques cellulaires SHP2 de type sauvage et mutantes. Ces analyses détectent de manière fiable l’engagement cible des inhibiteurs du SHP2 dans les cellules. Ici, nous fournissons un protocole complet de cet essai, qui fournit un outil précieux pour l’évaluation et la caractérisation des inhibiteurs du SHP2.

Introduction

La phosphorylation de la tyrosine joue un rôle important dans la transduction du signal dans^{les cellules 1,2}. Cette modification post-translationnelle est catalysée par des kinases de tyrosine protéique (PTKs) et inversée par des phosphatases de tyrosine protéique (PPR). Par conséquent, la fonction aberrante de PTK ou de PTP mène à beaucoup de maladies humaines^{héritées ou acquises 3,,4,,5,,6.} Le Src-homology 2 (SH2) contenant du domaine phosphatase 2 (SHP2) est un PTP de type non récepteur largement exprimé codé par le PTPN11⁷ proto-oncogène et est un régulateur clé de nombreux processus^{physiologiques}qui impliquent la transduction du signal par activation des voies de signalisation Ras/Raf/ERK, PI3K/Akt ou JAK/STAT. Normalement, l’activité SHP2 est étroitement réglementée afin d’éviter la signalisation aberrante. Dans des conditions basales, SHP2 est autoinhibited par son domaine SH2 N-terminal, qui bloque l’accès au site actif dans le domaine catalytique de phosphatase (Figure 1A)^9,10. Lors de l’activation cellulaire, les protéines liant la tyrosine phosphorylatées recrutent le SHP2, ce qui lui fait adopter sa conformation active, dans laquelle le site actif est désormais accessible à ses substrats. Dans de nombreux cancers, l’activité SHP2 est élevée. Des mutations somatiques de gain de fonction (GOF) dans PTPN11 ont été identifiées principalement dans les leucémies et empêchent la liaison du domaine de N-SH2 au domaine de phosphatase, ayant pour résultat le SHP2 constitutif actif (figure 1B)¹¹. Germline GOF mutations dans PTPN11 sont responsables d’environ 50% des cas de syndrome de Noonan, un trouble du développement avec un risque accru de malignité¹². Dans les tumeurs solides, où les mutations PTPN11 sont rares, des niveaux plus élevés de protéines liantes phosphorylatées conduisent à une activité SHP2 améliorée (Figure 1C). SHP2 est également important pour la signalisation de point de contrôle immunitaire, car les récepteurs de point de contrôle tels que BTLA ou PD-1 recrutent SHP2 pour déphosphorylate molécules de signalisation clés, empêchant l’activation des cellules^{immunitaires 13,14,15}.

Cibler les PNP avec de petites molécules a été un défi, parce que le site actif des PNP est fortement conservé et très chargé; les inhibiteurs qui ciblent le site actif sont souvent puissants, mais présentent une faible sélectivité et biodisponibilité orale^{16,17,18,19,20,21,22}. En effet, beaucoup d’inhibiteurs rapportés de SHP2 souffrent de la sélectivité pauvre et du manque d’efficacité dans les^{cellules 23.} Récemment, des inhibiteurs allosteriques de SHP2 avec la bonne puissance et l’excellente sélectivité ont été rapportés (par exemple, SHP099²⁴ et RMC-4550²⁵⁾et ont suscité l’intérêt renouvelé pour des inhibiteurs de SHP2. Les composés basés sur SHP099 et RMC-4550 sont actuellement en phase I essais cliniques pour traiter les tumeurs solides avec récepteur tyrosine kinase (RTK) activation de la voie^26,27. Bien que révolutionnaires, ces composés sont inefficaces contre de nombreux mutants oncogènes SHP2 qui conduisent la leukemogenèse chez un nombre important de patients atteints d’un cancer du^{sang 28,29,30}. Ce manque de puissance des composés de type SHP099 vers les variantes oncogènes SHP2 provient de leur mécanisme allosterique unique, car ils inhibent l’activité SHP2 en liant et en stabilisant la conformation inactive et fermée, qui est perturbée chez les mutants SHP2. En outre, basé sur un rapport récent³¹, les mécanismes adaptatifs de résistance dans les patients traités avec des inhibiteurs SHP099-like sont tout à fait concevables. Par conséquent, le développement d’inhibiteurs SHP2 de prochaine génération qui ciblent son état actif et ouvert fait l’objet d’intenses recherches.

La caractérisation de nouveaux inhibiteurs du SHP2 dans les cellules est un aspect essentiel du processus d’optimisation du plomb. L’engagement cible éprouvé de l’inhibiteur dans des conditions physiologiques fournit un niveau supplémentaire de confiance que les ressources pour la chimie médicinale sont efficacement déployées sur des composés avec l’efficacité cellulaire prometteuse. Dans le passé, plusieurs méthodes pour évaluer la liaison des inhibiteurs de petites molécules à leurs cibles ont été développées, principalement pour les kinases protéiques³². Pour développer un essai cellulaire d’engagement de cible de SHP2, nous avons utilisé un essai cellulaire de décalage thermique^33. Cet essai, semblable à l’analyse in vitro de décalage thermique (PTS) pour les protéines^34,surveille la stabilité thermique cible de protéine, qui est typiquement modifiée par la liaison des petites molécules. L’analyse originale est un test de faible débit qui utilise des anticorps pour quantifier les niveaux de protéines cibles. Alternativement, nous avons choisi une variante récemment rapportée de l’essai de décalage thermique qui utilise un essai de complémentation de fragment d’enzyme de β-galactosidase (EFC) essai (figure 2)^35. Pour ces expériences, la protéine d’intérêt est exprimée dans les cellules comme une protéine de fusion N- ou C-terminal portant une étiquette prolabel améliorée (ePL, un fragment d’acide aminé de 42 β-galactosidase). Les cellules sont ensuite transférées dans des plaques compatibles PCR de 384 puits et incubées avec des composés d’intérêt. Un thermocycleur est utilisé pour appliquer un gradient de température sur les cellules, dont les protéines dénoaturent et s’agrègent à mesure que la température augmente en fonction de leur stabilité thermique. La capacité d’un composé candidat de lier et de stabiliser la protéine d’intérêt se traduira par une stabilité thermique accrue de cette protéine. Par conséquent, à la suite de la lyse des cellules, les protéines étiquetées qui ont été stabilisées par un composé candidat resteront en solution à des températures plus élevées que les protéines étiquetées des cellules incubées avec le contrôle du véhicule. L’accepteur d’enzymes reporter (EA) est capable de compléter les protéines solubles étiquetées ePL, ce qui entraîne une activité détectable de β-galactosidase à l’aide d’un substrat de luminescence.

Nous avons récemment développé un essai cellulaire robuste de décalage thermique pour le SHP2 sauvage-type (SHP2-WT) et une variante oncogène fréquente de SHP2 (SHP2-E76K) dans un format miniaturisé de 384 puits^36. Ici, nous rapportons un protocole détaillé de cet essai, qui détecte de manière fiable l’engagement cible par les inhibiteurs de SHP2 dans les cellules et démontre un degré élevé de corrélation entre la puissance d’inhibiteur et les données cellulaires de décalage thermique. Le flux de travail général d’analyse est illustré à la figure 3. Notre plate-forme utilise des protéines de fusion ePL-SHP2 en phase terminale N. Pour la génération des plasmides d’expression pICP-ePL-N-SHP2-WT et pICP-ePL-N-SHP2-E76K, veuillez consulter notre récente publication³⁶. Cet essai peut être effectué à l’aide d’un gradient thermique pour établir des profils thermiques SHP2 et déterminer les températures de fusion du SHP2 en présence ou en l’absence d’inhibiteur. Une fois que les profils thermiques ont été établis, il peut également être effectué dans des conditions isothermales, permettant l’évaluation de dose-réponse d’inhibiteur. Les deux types d’expériences sont décrits ci-dessous.

Protocol

1. Préparation de la culture cellulaire et des reagents Formuler une bouteille de 500 mL de supports de croissance avec 10 % de sérum bovin fœtal, 1x antibiotique/antimicotique, 20 mM HEPES et 1 mM de pyruvate de sodium. Conserver à 4 °C. Décongeler les reagents cellulaires de décalage thermique (réageni EA, tampon de lyse et substrat) à partir de bouteilles de bouillon d’origine congelées. Distribuez les reagents et tampons sous forme d’aliquots de 2 mL et stockez-les à -20 ?…

Representative Results

L’expérience de gradient thermique pour SHP2-WT a donné lieu à un profil thermique cellulaire sigmoïdal avec une transition de fusion étroite qui est typique et cohérente pour une protéine pliée (Figure 4A). SHP2 se compose de trois domaines indépendants : deux domaines SH2 et le domaine catalytique (Figure 1). Dans la conformation fermée autoinhibited ces domaines s’associent eux-même ; la transition de fusion observée dans l’expérience de pr…

Discussion

Nous avons présenté un test d’engagement cible qui peut confirmer la liaison directe de petites molécules à la phosphatase SHP2 dans les cellules. L’analyse peut faire la distinction entre les inhibiteurs de faible et de haute affinité et, surtout, confirmer un manque de puissance par les inhibiteurs allosteriques du type SHP099 pour le mutant oncogène SHP2-E76K gof. Une force de cet essai miniaturisé est sa capacité à être intégrée dans une campagne de dépistage des inhibiteurs du SHP2. La capacité de …

Materials

384-well gradient equipped thermocycler	Eppendorf AG	X50h
384-well low dead volume microplate Echo qualified	Beckman Coulter, Inc.	LP-0200
6-well cell culture plates	Greiner Bio-One	657 160	Sterile with lid
Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X	Thermo Fisher Scientific	15240-062
Cell counter	Thermo Fisher Scientific	Countess II FL
Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	10566-016	500 mL
Echo acoustic liquid handler	Beckman Coulter, Inc.	Echo 550
Electronic multichannel pipette	Thermo Fisher Scientific	E1 ClipTip
Fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	26140-079	500 mL
HEPES buffer	Thermo Fisher Scientific	15630-680	100 mL
InCell Pulse starter kit	Eurofins DiscoverX Corp.	94-4007	Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate
Microplate reader	Tecan Trading AG	Spark
Single channel solution trough	Thermo Fisher Scientific	S253012005
Sodium pyruvate	Thermo Fisher Scientific	11360-010	100 mM
Thermal microplate sealer	Agilent Technologies, Inc.	PlateLoc
Transfection reagents	Polyplus Transfection	jetPRIME
Trypan blue	Thermo Fisher Scientific	T10282
TrypLE Express reagent	Thermo Fisher Scientific	12605-010
Twin.tec 384 real-time PCR plates	Eppendorf AG	30132734