הערכת מעורבות יעד סלולרי על ידי SHP2 (PTPN11) מעכבי פוספטאז
Summary
היכולת להעריך מעורבות היעד על ידי מעכבי מועמד בתאים שלמים היא קריטית לגילוי סמים. פרוטוקול זה מתאר 384 גם פורמט התא סלולרי תרמי shift assay כי אמין מזהה מעורבות היעד הסלולרי של מעכבים מיקוד SHP2 מסוג פראי או גרסאות oncogenic שלה.
Abstract
Src-homology 2 (SH2) תחום המכיל פוספטאז 2 (SHP2), מקודד על ידי PTPN11 פרוטו-אונקוגן, הוא מגשר מפתח של קולטן טירוסין kinase (RTK) תא מונחה איתות, קידום הישרדות תאים והתפשטות. בנוסף, SHP2 מגויס על ידי קולטני נקודת בדיקה חיסונית כדי לעכב את הפעלת תאי B ו-T. פונקציית SHP2 חריגה כבר מעורב בפיתוח, התקדמות, גרורות של סוגי סרטן רבים. אכן, מעכבי SHP2 מולקולה קטנה נכנסו לאחרונה ניסויים קליניים לטיפול בגידולים מוצקים עם ראס / Raf / ERK הפעלת מסלול, כולל גידולים עם כמה מוטציות ראס oncogenic. עם זאת, המחלקה הנוכחית של מעכבי SHP2 אינה יעילה נגד SHP2 גרסאות oncogenic המתרחשות לעתים קרובות לוקמיה, ופיתוח של מולקולות קטנות ספציפיות כי היעד ONcogenic SHP2 הוא הנושא של המחקר הנוכחי. בעיה נפוצה עם רוב הקמפיינים גילוי סמים מעורבים חלבונים cytosolic כמו SHP2 היא כי ההתאסה העיקרית כי כונן גילוי כימי הם לעתים קרובות במבחנה אסה כי אינם מדווחים על מעורבות היעד הסלולרי של תרכובות מועמד. כדי לספק פלטפורמה למדידת מעורבות היעד הסלולרי, פיתחנו הן את ההגדרות התרמיות הסלולריות מסוג פראי והן את המוטציה התרמית הסלולרית SHP2. אלה אומר אמין לזהות מעורבות היעד של מעכבי SHP2 בתאים. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מקיף של תסיסה זו, אשר מספק כלי בעל ערך להערכה ואפיון של מעכבי SHP2.
Introduction
פוספורילציה טירוסין ממלא תפקיד חשוב בהתמרת אותות בתאים1,,2. שינוי זה לאחר תרגום הוא תיז על ידי קינאזים טירוסין חלבון (PTKs) והפוך על ידי פוספטאז טירוזין חלבון (PTPs). לכן, פונקציית PTK או PTP חריגה מובילה למחלות אנושיות רבות שעברובירושה או נרכשו 3,,4,,5,,6. Src-homology 2 (SH2) פוספטאז המכיל תחום 2 (SHP2) הוא PTP מסוג שאינו קולטן מבוטא באופן נרחב מקודד על ידי PTPN11פרוטו-oncogene7 והוא רגולטור מרכזי של תהליכים פיזיולוגיים רבים המערבים תזוזת אותות על ידי הפעלת Ras / Raf / ERK, PI3K/Akt, או נתיבי איתות JAK/STAT8. בדרך כלל, פעילות SHP2 מוסדר בחוזקה כדי למנוע איתות חריג. בתנאים בסיסיים SHP2 הוא autoinhibited על ידי תחום SH2 N-מסוף שלה, אשר חוסם את הגישה לאתר הפעיל בתוך תחום פוספטאז קטליטי (איור 1A)9,,10. עם הפעלת התא, חלבוני איגוד phosphorylated טירוזין לגייס SHP2, גורם לו לאמץ את הקונפורמציה הפעילה שלה, שבו האתר הפעיל נגיש כעת מצעים שלה. בסרטן רבים פעילות SHP2 הוא גבוה. מוטציות רווח-של-תפקוד סומטי (GOF) ב PTPN11 זוהו בעיקר לוקמיה ולמנוע איגוד של תחום N-SH2 לתחום phosphatase, וכתוצאה מכך SHP2 פעיל באופן קונסטרטיבי (איור 1B)11. מוטציות GOF נבט PTPN11 אחראים ~ 50% מהמקרים של תסמונת נונאן, הפרעה התפתחותית עם סיכון מוגבר שלממאירות 12. בגידולים מוצקים, שבו מוטציות PTPN11 הן נדירות, רמות גבוהות יותר של חלבונים מחייב זרחן להוביל לפעילות SHP2 משופרת(איור 1C). SHP2 חשוב גם לאותות מחסום חיסוני, כמו קולטני מחסום כגון BTLA או PD-1 לגייס SHP2 כדי dephosphorylate מפתח איתות מולקולות, מניעת הפעלת תאים חיסוניים13,,14,,15.
מיקוד PTPs עם מולקולות קטנות כבר אתגר, כי האתר הפעיל של PTPs הוא מאוד שהוזמן וטעון מאוד; מעכבים המתמקדים באתר הפעיל הם לעתים קרובות חזקים, אבל להפגין לקטיביות ירודה ותוכן ביו אוראלי16,,17,18,19,20,,21,22. אכן, מעכבי SHP2 דיווח רבים סובלים מבחירה ירודה וחוסר יעילות בתאים23. לאחרונה, מעכבי allosteric של SHP2 עם עוצמה טובה ובוחריות מעולה דווחו (למשל, SHP09924 ו RMC-455025) והציתו עניין מחודש מעכבי SHP2. תרכובות המבוססות על SHP099 ו RMC-4550 נמצאים כעת בשלב I ניסויים קליניים לטיפול בגידולים מוצקים עם קולטן טירוסין קינאז (RTK)מסלול הפעלה 26,,27. בעוד פורץ דרך, תרכובות אלה אינם יעילים נגד רבים של מוטנטים oncogenic SHP2 המניעים leukemogenesis במספר משמעותי שלחולי סרטן הדם 28,29,30. חוסר עוצמה זה של תרכובות כמו SHP099 כלפי גרסאות oncogenic SHP2 נובע מנגנון אלהסטרי ייחודי שלהם, כפי שהם מעכבים את פעילות SHP2 על ידי איגוד וייצוב לא פעיל, סגור conformation, אשר משובש מוטנטים SHP2. יתר על כן, בהתבסס עלדו”ח האחרון 31, מנגנוני התנגדות אדפטיבית בחולים שטופלו מעכבים כמו SHP099 הם די מתקבלים על הדעת. כתוצאה מכך, הפיתוח של מעכבי SHP2 הדור הבא המתמקדים במצבה הפעיל והפתוח הוא נושא למחקר אינטנסיבי.
האפיון של מעכבי SHP2 רומן בתאים הוא היבט חיוני של תהליך אופטימיזציה להוביל. באופן קריטי, מעורבות יעד מוכחת של המעכב בתנאים פיזיולוגיים מספק רמה נוספת של ביטחון כי משאבים לכימיה מרפאת פרוסים ביעילות על תרכובות עם יעילות תאית מבטיחה. בעבר, פותחו מספר שיטות להערכת הכריכה של מעכבי מולקולות קטנות ליעדים שלהם, בעיקר עבור קינאז חלבון32. כדי לפתח תסיסה של מעורבות יעד סלולרי SHP2, השתמשנו ב- assay33 שלמשמרת תרמית סלולרית. הודעה זו, בדומה לתנועתה התרמית במבחנה (PTS)לחלבונים 34, מנטרת את היציבות התרמית של חלבון היעד, אשר משתנה בדרך כלל על ידי איגוד מולקולות קטנות. ההסתה המקורית היא תפוקה נמוכה המשתמשת נוגדנים כדי לכמת את רמות חלבון היעד. לחלופין, בחרנו גרסה שדווחה לאחרונה של תסיסה תרמית המנצלת β-galactosidase אנזים שבר משלים (EFC) תס”א(איור 2)35. עבור ניסויים אלה, החלבון של עניין בא לידי ביטוי בתאים כחלבון היתוך N-או C-מסוף נושא תג ProLabel משופרת (ePL, שבר חומצת אמינו 42 של β-galactosidase). לאחר מכן, תאים מועברים להצלחות תואמות PCR של 384 בארות ומשוברים בתרכובות עניין. thermocycler מנוצל כדי להחיל מעבר צבע טמפרטורה על התאים, חלבונים אשר יהיה denature וצבירה ככל שהטמפרטורה עולה בהתבסס על היציבות התרמית שלהם. היכולת של תרכובת מועמד לאגד ולייצב את החלבון של עניין תגרום ליציבות תרמית מוגברת של חלבון זה. לכן, בעקבות הליזה של התאים, אותם חלבונים מתויגים שהתייצבו על ידי תרכובת מועמד יישארו בפתרון בטמפרטורות גבוהות יותר מאשר חלבונים מתויגים של תאים דגירה עם בקרת רכב. כתב אנזים מקבל (EA) הוא מסוגל להשלים את החלבונים מסיסים ePL מתויג, וכתוצאה מכך פעילות β-galactosidase לגילוי באמצעות מצע זוהר.
לאחרונה פיתחנו תסיסה תרמית תאית חזקה עבור SHP2 מסוג פראי (SHP2-WT) וגרסה אונקוגנית תכופה SHP2 (SHP2-E76K) בפורמט מצומצם של 384בארות 36. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול מפורט של תסיסה זו, אשר מזהה באופן אמין מעורבות היעד על ידי מעכבי SHP2 בתאים ומדגים רמה גבוהה של מתאם בין עוצמה מעכבת ונתוני משמרת תרמית סלולרית. זרימת העבודה הכללית של תרגום מומחה באות 3. הפלטפורמה שלנו משתמשת בחלבונים באורך מלא של EPL-SHP2 באורך מלא. עבור הדור של פלסמידות ביטוי pICP-ePL-N-SHP2-WT ו pICP-ePL-N-SHP2-E76K, נא עיין בפרסוםהאחרון שלנו 36. תסיסה זו יכולה להתבצע באמצעות מעבר צבע תרמי כדי לבסס פרופילים תרמיים SHP2 ולקבוע טמפרטורות התכה SHP2 בנוכחות או היעדר מעכב. לאחר פרופילים תרמיים הוקמו, זה יכול להתבצע גם בתנאים isothermal, המאפשר מעכב מינון תגובה הערכה. שני סוגי הניסויים מתוארים להלן.
Protocol
Representative Results
Discussion
יש לנו הציג סיסמת מעורבות היעד שיכול לאשר איגוד ישיר של מולקולות קטנות לפוספטאז SHP2 בתאים. ההסתה יכולה להפלות בין מעכבי זיקה נמוכה וגבוהה, וחשוב מכך, לאשר חוסר עוצמה על ידי מעכבי allosteric של SHP099-סוג עבור מוטנט SHP2-E76K oncogenic GOF. כוחה של כך ממזערת היא יכולתה להשתלב בקמפיין הקרנה מעכב SHP2. היכולת של ההס…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק 1R21CA195422 (ל.ט.), פרס קרן משפחת אפשטיין (N.D. P.C.) ו NCI מרכז תמיכה מרכז P30CA030199. בנוסף, פרויקט זה מומן במלואו או בחלקו עם כספים פדרליים מהמכון הלאומי לסרטן, המכונים הלאומיים לבריאות, תחת חוזה קונסורציום ביולוגיה כימית לא. HHSN261200800001E. תוכן פרסום זה אינו משקף בהכרח את השקפותיו או מדיניותו של משרד הבריאות ושירותי האנוש, ואינו מזכיר שמות מסחריים, מוצרים מסחריים או ארגונים המרמזים על תמיכה של ממשלת ארה”ב. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים ואינו מייצג בהכרח את השקפותיהם הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.
Materials
| 384-well gradient equipped thermocycler | Eppendorf AG | X50h | |
| 384-well low dead volume microplate Echo qualified | Beckman Coulter, Inc. | LP-0200 | |
| 6-well cell culture plates | Greiner Bio-One | 657 160 | Sterile with lid |
| Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X | Thermo Fisher Scientific | 15240-062 | |
| Cell counter | Thermo Fisher Scientific | Countess II FL | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 10566-016 | 500 mL |
| Echo acoustic liquid handler | Beckman Coulter, Inc. | Echo 550 | |
| Electronic multichannel pipette | Thermo Fisher Scientific | E1 ClipTip | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140-079 | 500 mL |
| HEPES buffer | Thermo Fisher Scientific | 15630-680 | 100 mL |
| InCell Pulse starter kit | Eurofins DiscoverX Corp. | 94-4007 | Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate |
| Microplate reader | Tecan Trading AG | Spark | |
| Single channel solution trough | Thermo Fisher Scientific | S253012005 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-010 | 100 mM |
| Thermal microplate sealer | Agilent Technologies, Inc. | PlateLoc | |
| Transfection reagents | Polyplus Transfection | jetPRIME | |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| TrypLE Express reagent | Thermo Fisher Scientific | 12605-010 | |
| Twin.tec 384 real-time PCR plates | Eppendorf AG | 30132734 |
Riferimenti
- Hunter, T. Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting. Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).
- Alonso, A., et al. Protein tyrosine phosphatases in the human genome. Cell. 117 (6), 699-711 (2004).
- Cohen, P. Protein kinases-the major drug targets of the twenty-first century. Nature Reviews Drug Discovery. 1 (4), 309 (2002).
- Ferguson, F. M., Gray, N. S. Kinase inhibitors: the road ahead. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (5), 353-377 (2018).
- Stanford, S. M., Bottini, N. Targeting Tyrosine Phosphatases: Time to End the Stigma. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (6), 524-540 (2017).
- Tonks, N. Protein tyrosine phosphatases–from housekeeping enzymes to master regulators of signal transduction. FEBS Journal. 280 (2), 346-378 (2013).
- Chan, R., Feng, G. PTPN11 is the first identified proto-oncogene that encodes a tyrosine phosphatase. Blood. 109 (3), 862-867 (2007).
- Chan, G., Kalaitzidis, D., Neel, B. The tyrosine phosphatase Shp2 (PTPN11) in cancer. Cancer Metastasis Rev. 27 (2), 179-192 (2008).
- Hof, P., Pluskey, S., Dhe-Paganon, S., Eck, M., Shoelson, S. Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2. Cell. 92 (4), 441-450 (1998).
- Barford, D., Neel, B. Revealing mechanisms for SH2 domain mediated regulation of the protein tyrosine phosphatase SHP-2. Structure. 6 (3), 249-254 (1998).
- Neel, B. G., Chan, G., Dhanji, S. . Handbook of Cell Signaling (Second Edition). 2, 771-809 (2010).
- Tartaglia, M., et al. Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome. Nature Genetics. 29 (4), 465-468 (2001).
- Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
- Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (24), 13866-13871 (2001).
- Watanabe, N., et al. BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA-4 and PD-1. Nature Immunology. 4 (7), 670-679 (2003).
- Bialy, L., Waldmann, H. Inhibitors of protein tyrosine phosphatases: next-generation drugs. Angewandte Chemie International Edition England. 44 (25), 3814-3839 (2005).
- Kumar, S., Liang, F., Lawrence, D., Zhang, Z. Small molecule approach to studying protein tyrosine phosphatase. Methods. 35 (1), 9-21 (2005).
- Tautz, L., Pellecchia, M., Mustelin, T. Targeting the PTPome in human disease. Expert Opinion in Thereapeutics Targets. 10 (1), 157-177 (2006).
- Tautz, L., Mustelin, T. Strategies for developing protein tyrosine phosphatase inhibitors. Methods. 42 (3), 250-260 (2007).
- Vintonyak, V., Antonchick, A., Rauh, D., Waldmann, H. The therapeutic potential of phosphatase inhibitors. Current Opinion in Chemical Biology. 13 (3), 272-283 (2009).
- Barr, A. Protein tyrosine phosphatases as drug targets: strategies and challenges of inhibitor development. Future Medicinal Chemistry. 2 (10), 1563-1576 (2010).
- He, R., Zeng, L., He, Y., Zhang, S., Zhang, Z. Small molecule tools for functional interrogation of protein tyrosine phosphatases. FEBS Journal. 280, 731-750 (2012).
- Tsutsumi, R., Ran, H., Neel, B. G. Off-target inhibition by active site-targeting SHP2 inhibitors. FEBS Open Biology. 8 (9), 1405-1411 (2018).
- Chen, Y. N., et al. Allosteric inhibition of SHP2 phosphatase inhibits cancers driven by receptor tyrosine kinases. Nature. 535 (7610), 148-152 (2016).
- Nichols, R. J., et al. RAS nucleotide cycling underlies the SHP2 phosphatase dependence of mutant BRAF-, NF1- and RAS-driven cancers. Nature Cell Biology. 20 (9), 1064-1073 (2018).
- . Clinical Trial NCT03114319 Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1 (2019)
- . Clinical Trial NCT03634982 Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1 (2019)
- Sun, X., et al. Selective inhibition of leukemia-associated SHP2(E69K) mutant by the allosteric SHP2 inhibitor SHP099. Leukemia. 32 (5), 1246-1249 (2018).
- LaRochelle, J. R., et al. Structural reorganization of SHP2 by oncogenic mutations and implications for oncoprotein resistance to allosteric inhibition. Nature Communication. 9 (1), 4508 (2018).
- Padua, R. A. P., et al. Mechanism of activating mutations and allosteric drug inhibition of the phosphatase SHP2. Nature Communication. 9 (1), 4507 (2018).
- Lu, H., et al. Resistance to allosteric SHP2 inhibition in FGFR-driven cancers through rapid feedback activation of FGFR. Oncotarget. 11 (3), 265-281 (2020).
- Smyth, L. A., Collins, I. Measuring and interpreting the selectivity of protein kinase inhibitors. Journal of Chemical Biology. 2 (3), 131-151 (2009).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Ericsson, U., Hallberg, B., Detitta, G., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
- McNulty, D. E., et al. A High-Throughput Dose-Response Cellular Thermal Shift Assay for Rapid Screening of Drug Target Engagement in Living Cells, Exemplified Using SMYD3 and IDO1. SLAS Discovery. 23 (1), 34-46 (2018).
- Romero, C., et al. A cellular target engagement assay for the characterization of SHP2 (PTPN11) phosphatase inhibitors. Journal of Biological Chemistry. 295 (9), 2601-2613 (2020).
- Ran, H., Tsutsumi, R., Araki, T., Neel, B. G. Sticking It to Cancer with Molecular Glue for SHP2. Cancer Cell. 30 (2), 194-196 (2016).
