Valutazione dell'impegno del bersaglio cellulare da parte degli inibitori della fosfatasi SHP2 (PTPN11)

Summary

La capacità di valutare l’impegno target da parte degli inibitori candidati nelle cellule intatte è fondamentale per la scoperta di farmaci. Questo protocollo descrive un saggio di spostamento termico cellulare in formato 384 che rileva in modo affidabile l’impegno del bersaglio cellulare degli inibitori che prendono di mira SHP2 di tipo selvaggio o le sue varianti oncogeniche.

Abstract

La fosfatasi 2 (SH2) contenente dominio Src-omologia 2 (SHP2), codificata dal proto-oncogene PTPN11, è un mediatore chiave della segnalazione cellulare guidata dalla tirosina chinasi recettore (RTK), promuovendo la sopravvivenza e la proliferazione cellulare. Inoltre, SHP2 viene reclutato dai recettori dei punti di controllo immunitario per inibire l’attivazione delle cellule B e T. La funzione Aberrant SHP2 è stata implicata nello sviluppo, nella progressione e nella metastasi di molti tumori. Infatti, gli inibitori della piccola molecola SHP2 sono recentemente entrati in studi clinici per il trattamento di tumori solidi con attivazione della via Ras / Raf / ERK, compresi i tumori con alcune mutazioni ras oncogeniche. Tuttavia, l’attuale classe di inibitori dell’SHP2 non è efficace contro le varianti oncogeniche SHP2 che si verificano frequentemente nelle leucemie, e lo sviluppo di piccole molecole specifiche che prendono di mira l’SHP2 oncogenico è oggetto di ricerche attuali. Un problema comune con la maggior parte delle campagne di scoperta di farmaci che coinvolgono proteine citosoliche come SHP2 è che i test primari che guidano la scoperta chimica sono spesso saggi in vitro che non riportano l’impegno target cellulare dei composti candidati. Per fornire una piattaforma per misurare l’engagement del bersaglio cellulare, abbiamo sviluppato test di spostamento termico cellulare SHP2 sia di tipo selvaggio che mutante. Questi test rilevano in modo affidabile l’impegno target degli inibitori di SHP2 nelle cellule. Qui, forniamo un protocollo completo di questo saggio, che fornisce uno strumento prezioso per la valutazione e la caratterizzazione degli inibitori di SHP2.

Introduction

La fosforilazione della tirosina svolge un ruolo importante nella trasduzione del segnale nelle^{celle 1,2}. Questa modifica post-traslazionale è catalizzata da proteina tirosina chinasi (PTT) e invertita da proteina tirosina fosfatasi (PTP). Pertanto, la funzione PTK o PTP aberrante porta a molte malattie umane ereditarie o acquisite^3,4,5,6. La Src-omologia 2 (SH2) contenente il dominio fosfatasi 2 (SHP2) è un PTP di tipo non recettore ampiamente espresso codificato dal proto-oncogene PTPN11⁷ ed è un regolatore chiave di numerosi processi fisiologici che comportano la trasduzione del segnale tramite attivazione delle vie di segnalazione Ras/ Raf / ERK, PI3K / Akt o JAK / STAT⁸. Normalmente, l’attività SHP2 è strettamente regolata al fine di prevenire la segnalazione aberrante. In condizioni basali SHP2 è autoibitato dal suo dominio SH2 N-terminale, che blocca l’accesso al sito attivo all’interno del dominio della fosfatasi catalitica (Figura 1A)^9,10. Al momento dell’attivazione cellulare, le proteine leganti fosforilate della tirosina reclutano SHP2, facendolo adottare la sua conformazione attiva, in cui il sito attivo è ora accessibile ai suoi substrati. In molti tumori l’attività SHP2 è elevata. Mutazioni del guadagno di funzione somatico (GOF) in PTPN11 sono state identificate principalmente nelle leucemie e impediscono il legame del dominio N-SH2 al dominio fosfatasi, con conseguente SHP2 costitutivamente attivo (Figura 1B)¹¹. Le mutazioni gof germinali in PTPN11 sono responsabili di ~ 50% dei casi di sindrome di Noonan, un disturbo dello sviluppo con un aumento del rischio di malignit๲. Nei tumori solidi, dove le mutazioni di PTPN11 sono rare, maggiori livelli di proteine leganti fosforilate portano ad una maggiore attività SHP2 (Figura 1C). SHP2 è anche importante per la segnalazione del checkpoint immunitario, poiché i recettori del checkpoint come BTLA o PD-1 reclutano SHP2 per defosforilato le molecole di segnalazione della chiave, impedendo l’attivazione^{delle cellule immunitarie 13,,14,,15}.

Indirizzare i PTP con piccole molecole è stata una sfida, perché il sito attivo dei PTP è altamente conservato e altamente carico; gli inibitori che prendono di mira il sito attivo sono spesso potenti, ma mostrano scarsa selettività e biodisponibilità orale^{16,,17,,18,,19,,20,,21,,22}. Infatti, molti inibitori di SHP2 segnalati soffrono di scarsa selettività e mancanza di efficacia nelle cellule²³. Recentemente, sono stati segnalati inibitori allosterici di SHP2 con buona potenza e eccellente selettività (ad esempio, SHP099²⁴ e RMC-4550²⁵) e hanno suscitato un rinnovato interesse per gli inibitori di SHP2. I composti a base di SHP099 e RMC-4550 sono attualmente in fase I studi clinici per trattare tumori solidi con attivazione del percorso della tirosina chinasi recettore (RTK)^26,,27. Sebbene innovativi, questi composti sono inefficaci contro molti dei mutanti oncogenici SHP2 che guidano la leucemogenesi in un numero significativo di pazienti con cancro del^{sangue 28,29,30}. Questa mancanza di potenza dei composti simili a SHP099 verso le varianti oncogeniche SHP2 deriva dal loro meccanismo allosterico unico, in quanto inibiscono l’attività SHP2 legando e stabilizzando la conformazione inattiva e chiusa, che viene interrotta nei mutanti SHP2. Inoltre, sulla base di un recente rapporto³¹, i meccanismi di resistenza adattativa nei pazienti trattati con inibitori simili a SHP099 sono del tutto concepibili. Di conseguenza, lo sviluppo di inibitori SHP2 di nuova generazione che prendono di mira il suo stato attivo e aperto è oggetto di intense ricerche.

La caratterizzazione di nuovi inibitori SHP2 nelle cellule è un aspetto essenziale del processo di ottimizzazione del piombo. Criticamente, l’impegno target comprovato dell’inibitore in condizioni fisiologiche fornisce un ulteriore livello di fiducia nel fatto che le risorse per la chimica medicinale siano utilizzate in modo efficiente su composti con promettente efficacia cellulare. In passato, sono stati sviluppati diversi metodi per valutare il legame degli inibitori di piccole molecole ai loro obiettivi, principalmente per le chinasi proteiche³². Per sviluppare un test di coinvolgimento del bersaglio cellulare SHP2, abbiamo utilizzato un saggio di spostamento termico cellulare³³. Questo saggio, simile al saggio di spostamento termico in vitro (PTS) per le proteine³⁴, monitora la stabilità termica della proteina bersaglio, che è tipicamente alterata dal legame di piccole molecole. Il saggio originale è un saggio a bassa produttività che utilizza anticorpi per quantificare i livelli proteici bersaglio. In alternativa, abbiamo scelto una variante recentemente riportata del saggio di spostamento termico che utilizza un saggio di complementazione dei frammenti enzimatici β-galattosidasi (EFC)(Figura 2)³⁵. Per questi esperimenti, la proteina di interesse è espressa nelle cellule come una proteina di fusione N o C-terminale che porta un tag ProLabel migliorato (ePL, un frammento di 42 amminoacidi di β-galattosidasi). Le cellule vengono quindi trasferite in piastre compatibili con PCR a 384 pozzi e incubate con composti di interesse. Un termociclo viene utilizzato per applicare un gradiente di temperatura alle cellule, le cui proteine si denaturano e si aggregano man mano che la temperatura aumenta in base alla loro stabilità termica. La capacità di un composto candidato di legare e stabilizzare la proteina di interesse si tradurrà in una maggiore stabilità termica di quella proteina. Pertanto, a seguito della lisi delle cellule, le proteine taggate che sono state stabilizzate da un composto candidato rimarranno in soluzione a temperature più elevate rispetto alle proteine taggate delle cellule incubate con il controllo del veicolo. L’accettore enzimatico Reporter (EA) è in grado di integrare le proteine solubili taggate ePL, risultando in un’attività rilevabile β-galattosidasi utilizzando un substrato di luminescenza.

Recentemente abbiamo sviluppato un robusto test di spostamento termico cellulare per SHP2 di tipo selvaggio (SHP2-WT) e una frequente variante oncogenica SHP2 (SHP2-E76K) in un formato miniaturizzato 384-well³⁶. Qui, reportiamo un protocollo dettagliato di questo saggio, che rileva in modo affidabile l’impegno del bersaglio da parte degli inibitori SHP2 nelle cellule e dimostra un alto grado di correlazione tra la potenza dell’inibitore e i dati dello spostamento termico cellulare. Il flusso di lavoro generale dei saggi è illustrato nella figura 3. La nostra piattaforma utilizza proteine di fusione ePL-SHP2 a lunghezza intera taggate n-terminale. Per la generazione dei corrispondenti plasmidi di espressione pICP-ePL-N-SHP2-WT e pICP-ePL-N-SHP2-E76K, fare riferimento alla nostra recente pubblicazione³⁶. Questo test può essere eseguito utilizzando un gradiente termico per stabilire profili termici SHP2 e determinare le temperature di fusione SHP2 in presenza o assenza di inibitore. Una volta stabiliti i profili termici, può anche essere eseguito in condizioni isotermiche, consentendo la valutazione della dose-risposta dell’inibitore. Entrambi i tipi di esperimenti sono descritti di seguito.

Protocol

1. Preparazione della coltura cellulare e dei reagenti Formulare una bottiglia da 500 ml di mezzi di crescita con siero bovino fetale al 10%, 1x antibiotico/antimicotico, 20 mM HEPES e 1 mM di piruvato di sodio. Conservare a 4 °C. Scongelare i reagenti di spostamento termico cellulare (reagente EA, tampone di lysis e substrato) da bottiglie di magazzino originali congelate. Erogare reagenti e tamponare come aliquote da 2 mL e conservare a -20 °C.NOTA: Evitare il congelamento/scongelame…

Representative Results

L’esperimento del gradiente termico per SHP2-WT ha portato a un profilo termico cellulare sigmoidale con una stretta transizione di fusione tipica e coerente per una proteina piegata (Figura 4A). SHP2 è costituito da tre domini indipendenti: due domini SH2 e il dominio catalitico (Figura 1). Nella conformazione chiusa automaticamente inibita questi domini si associano automaticamente; la transizione di fusione osservata nell’esperimento del profilo termico rifl…

Discussion

Abbiamo presentato un saggio di coinvolgimento target in grado di confermare il legame diretto di piccole molecole alla fosfatasi SHP2 nelle cellule. Il saggio può discriminare tra inibitori a bassa e alta affinità e, cosa importante, confermare una mancanza di potenza da parte degli inibitori allosterici del tipo SHP099 per il mutante oncogenico GOF SHP2-E76K. Un punto di forza di questo test miniaturizzato è la sua capacità di essere integrato in una campagna di screening inibitore SHP2. La capacità del saggio di …

Materials

384-well gradient equipped thermocycler	Eppendorf AG	X50h
384-well low dead volume microplate Echo qualified	Beckman Coulter, Inc.	LP-0200
6-well cell culture plates	Greiner Bio-One	657 160	Sterile with lid
Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X	Thermo Fisher Scientific	15240-062
Cell counter	Thermo Fisher Scientific	Countess II FL
Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	10566-016	500 mL
Echo acoustic liquid handler	Beckman Coulter, Inc.	Echo 550
Electronic multichannel pipette	Thermo Fisher Scientific	E1 ClipTip
Fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	26140-079	500 mL
HEPES buffer	Thermo Fisher Scientific	15630-680	100 mL
InCell Pulse starter kit	Eurofins DiscoverX Corp.	94-4007	Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate
Microplate reader	Tecan Trading AG	Spark
Single channel solution trough	Thermo Fisher Scientific	S253012005
Sodium pyruvate	Thermo Fisher Scientific	11360-010	100 mM
Thermal microplate sealer	Agilent Technologies, Inc.	PlateLoc
Transfection reagents	Polyplus Transfection	jetPRIME
Trypan blue	Thermo Fisher Scientific	T10282
TrypLE Express reagent	Thermo Fisher Scientific	12605-010
Twin.tec 384 real-time PCR plates	Eppendorf AG	30132734