SHP2(PTPN11) 포스파타제 억제제에 의한 세포 표적 참여 평가
Summary
그대로 세포에서 후보 억제제에 의한 표적 참여를 평가하는 능력은 약물 발견에 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 야생 형 SHP2 또는 종양 발생 변이체를 대상으로 억제제의 셀룰러 표적 참여를 안정적으로 감지하는 384 개의 잘 포맷 셀룰러 열 이동 분석서를 설명합니다.
Abstract
PTPN11 프로토 온코진에 의해 인코딩된 Src-homology 2(SH2) 도메인 함유 인산체 2(SHP2)는 수용체 티로신 키나아제(RTK)구동 세포 신호의 핵심 중재자이며 세포 생존 및 증식을 촉진한다. 또한, SHP2는 B 및 T 세포 활성화를 저해하기 위해 면역 체크포인트 수용체에 의해 모집된다. Aberrant SHP2 기능은 많은 암의 발달, 진행 및 전이에 연루되었습니다. 실제로, 소분자 SHP2 억제제는 최근에 Ras/Raf/ERK 통로 활성화를 가진 고형 종양의 처리를 위한 임상 시험을 입력했습니다, 몇몇 종양성 Ras 돌연변이를 가진 종양을 포함하여. 그러나, SHP2 억제제의 현재 클래스는 백혈병에서 빈번히 발생하는 SHP2 온코겐이체에 대하여 효과적이지 않으며, 온코겐성 SHP2를 표적으로 하는 특정 소분자의 개발은 현재 연구의 대상이다. SHP2 와 같은 세포질 단백질을 관련시키는 대부분의 약 발견 캠페인의 일반적인 문제점은 화학 발견을 유도하는 1 차적인 약이 수시로 후보 화합물의 세포 표적 참여를 보고하지 않는 시험관 내 분석을 한다는 것입니다. 셀룰러 표적 참여측정 플랫폼을 제공하기 위해 야생형 및 돌연변이 SHP2 세포열 시프트 분석을 모두 개발했습니다. 이러한 소심은 세포내 SHP2 억제제의 표적 참여를 안정적으로 검출한다. 여기서 는 SHP2 억제제의 평가 및 특성화를 위한 귀중한 도구를 제공하는 이 분석법의 포괄적인 프로토콜을 제공합니다.
Introduction
티로신 인산화는 세포1,,2에서신호 변환에 중요한 역할을 한다. 이 번역 후 변형은 단백질 티로신 키나아제 (PTKs)에 의해 촉매되고 단백질 티로신 인스파타제 (PTP)에 의해 반전됩니다. 따라서, 비정상적인 PTK 또는 PTP 기능은 많은 상속 또는 획득된 인간질환3,4,4,,5,6로이어집니다. Src-homology 2 (SH2) 도메인 함유 인산염 2 (SHP2)는 프로토 온코진 PTPN117에 의해 인코딩된 널리 발현된 비수용체 형 PTP이며 Ras/Raf/ERK, PI3K/Akt의 활성화에 의한 신호변환을포함하는 수많은 생리적 과정의 주요 레귤레이터이며, 8. 일반적으로 SHP2 활동은 비정상적인 신호를 방지하기 위해 엄격하게 조절됩니다. 기저 조건하에서 SHP2는 촉매 인광파아제 도메인 내의 활성 부위에 대한 액세스를 차단하는 N 단말 SH2 도메인에 의해 자동 억제된다(그림1A)9,,10. 세포 활성화 시, 티로신 인스포이드 결합 단백질은 SHP2를 모집하여 활성 부위가 기판에 접근할 수 있는 활성 형성을 채택하게 됩니다. 많은 암에서 SHP2 활동이 상승합니다. PTPN11의 체세포 게인(GOF) 돌연변이는 주로 백혈병에서 확인되었으며 N-SH2 도메인의 결합을 포스파타제 도메인으로 방지하여 구성활성 SHP2(도1B)11을초래한다. PTPN11의 생식선 GOF 돌연변이는 누난 증후군의 경우 ~50%,악성종양12의위험이 증가하는 발달 장애에 대한 책임이 있다. PTPN11 돌연변이가 드문 고형 종양에서는 인광결합 단백질의 수치가 더 높으며, 이는 향상된 SHP2활성(도 1C)으로이어진다. SHP2는 또한 면역 체크포인트 신호에 중요하며, BTLA 또는 PD-1과 같은 체크포인트 수용체는 SHP2를 모집하여 주요 신호 분자를 탈포하여 면역 세포활성화를방지13,14,,15.
PTP의 활성 부위가 매우 보존되고 고도로 충전되어 있기 때문에 작은 분자로 PTP를 타겟팅하는 것은 어려운 일이었습니다. 활성 부위를 표적으로 하는 억제제는 종종 강력하지만, 선택도 및 경구 생체 이용률이 떨어지는16,,17,,18,,19,,20,,21,,22를나타낸다. 실제로, 많은 보고 된 SHP2 억제제 가난한 선택성 및 세포에 효능의 부족에서 고통(23). 최근에는 SHP2의 알로스테릭 억제제와 우수한 선택성을 가진 알로스터리 억제제(예를 들어, SHP09924 및 RMC-455025)가보고되었으며 SHP2 억제제에 대한 관심을 새롭게 촉발시켰습니다. SHP099 및 RMC-4550에 기초한 화합물은 현재 수용체 티로신 키나아제(RTK) 경로활성화(26,27)로고형 종양을 치료하는 I상 임상시험에서현재 이다. 획기적인 동안, 이러한 화합물은 혈액암 환자의 상당수에서 백혈구 발생을 구동 하는 SHP2 종양 발생 돌연변이의 많은에 대 한 효과적 이다28,,29,,30. SHP2 온코겐성 변이체를 향한 SHP099와 같은 화합물의 효능부족은 SHP2 돌연변이체에서 중단되는 비활성 폐쇄 된 변형을 결합하고 안정화하여 SHP2 활동을 억제하기 때문에 독특한 알로스터 메커니즘에서 비롯됩니다. 또한, 최근보고서(31)에기초하여, SHP099와 같은 억제제로 치료받은 환자에서 적응성 내성 메커니즘은 매우 생각할 수 있다. 따라서, 활성을 대상으로 차세대 SHP2 억제제의 개발, 개방 상태는 강렬한 연구의 대상이다.
세포내의 새로운 SHP2 억제제의 특성화는 납 최적화 과정의 필수적인 측면이다. 비판적으로, 생리 조건 하에서 억제제의 입증 된 대상 참여는 약화학에 대 한 자원이 효율적으로 유망한 세포 효능화합물에 배포 되는 신뢰의 추가 수준을 제공. 과거에는, 그들의 표적에 작은 분자 억제제의 결합을 평가하는 몇몇 방법은 주로 단백질 키나아제(32)를위해 개발되었습니다. SHP2 셀룰러 표적 참여 분석기를 개발하기 위해 셀룰러 열 변화분석33을활용했습니다. 이러한 분석법은,단백질(34)에대한 체외 열 시프트(PTS) 분석과 유사하게, 표적 단백질 열 안정성을 모니터링하며, 이는 전형적으로 소분자의 결합에 의해 변화된다. 본래 분석은 표적 단백질 수준을 정량화하기 위해 항체를 활용하는 낮은 처리량 분석입니다. 대안적으로, 최근에 보고된 열시프트 분석법의 이체를 선택하여 β-갈라토시다아제 효소 단편 상보화(EFC)분석(도 2)35를이용한다. 이러한 실험의 경우, 관심 있는 단백질은 향상된 ProLabel 태그를 운반하는 N-또는 C 단말 융합 단백질로서 세포에서 발현된다(ePL, β 갈라토시다제의 42아미노산 단편). 세포는 384웰 PCR 호환 플레이트로 옮겨지고 관심 있는 화합물로 배양됩니다. 열사이클러는 열 안정성에 따라 온도가 증가함에 따라 단백질이 변성되고 집계되는 세포에 온도 그라데이션을 적용하는 데 사용됩니다. 관심 있는 단백질을 결합하고 안정화시키는 후보 화합물의 능력은 그 단백질의 열 안정성증가를 초래할 것이다. 따라서, 세포의 용액에 따라, 후보 화합물에 의해 안정화된 태그된 단백질은 차량 제어로 배양된 세포의 태그된 단백질보다 더 높은 온도에서 용액에 남아 있을 것이다. 리포터 효소 수용자(EA)는 용해성 ePL 태그 단백질을 보완할 수 있어 발광 기판을 사용하여 검출 가능한 β-갈라코시다제 활성을 생성한다.
최근 야생형 SHP2(SHP2-WT)에 대한 견고한 세포열 변속 분석과 소형 384웰 포맷36에서빈번한 SHP2 온코겐성 변종(SHP2-E76K)을 개발했다. 여기서, 우리는 안정적으로 세포에 있는 SHP2 억제제에 의한 표적 참여를 검출하고 억제제 힘 및 세포 열 이동 데이터 사이 상관관계의 높은 수준을 보여주는 이 분석의 상세한 프로토콜을 보고합니다. 일반적인 분석 워크플로우는 그림 3에나와 있습니다. 우리의 플랫폼은 N 단말 태그 전체 길이 ePL-SHP2 융합 단백질을 사용합니다. 해당 pICP-ePL-N-SHP2-WT 및 pICP-ePL-N-SHP2-E76K 발현 플라스미드의 생성을 위해, 최근 간행물36을참조하십시오. 이러한 분석은 열 그라데이션을 사용하여 SHP2 열 프로파일을 설정하고 억제제의 존재 또는 부재 시 SHP2 용융 온도를 결정할 수 있다. 열 프로파일이 확립되면, 그것은 또한 억제제 용량 반응 평가를 허용, 비등 조건하에서 수행 될 수있다. 두 가지 유형의 실험은 다음과 같습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 세포에서 SHP2 인산염에 작은 분자의 직접적인 결합을 확인할 수 있는 표적 참여 분석서를 제출했습니다. 상기 분석체는 낮은 친화성 억제제를 구별할 수 있으며, 중요한 것은 GOF 온코겐성 SHP2-E76K 돌연변이체에 대한 SHP099형의 알로스테릭 억제제에 의한 효능의 부족을 확인할 수 있다. 이 소형 분석의 강점은 SHP2 억제제 스크리닝 캠페인에 통합될 수 있는 능력입니다. 알 수 없는 화학 물질에…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 건강 보조금 1R21CA195422 (L. T.), 엡스타인 가족 재단 상 (N. D. P.C.), NCI 암 센터 지원 보조금 P30CA030199의 국립 학회에 의해 지원되었다. 또한,이 프로젝트는 화학 생물학 컨소시엄 계약 번호에 따라 국립 암 연구소, 국립 보건 원의 연방 기금으로 전체 또는 부분적으로 자금을 지원받았습니다. HHSN2612008000001E. 이 출판물의 내용은 반드시 보건 복지부의 견해나 정책을 반영하지 않으며, 미국 정부의 보증을 암시하는 무역 이름, 상업용 제품 또는 조직에 대한 언급도 아닙니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
Materials
| 384-well gradient equipped thermocycler | Eppendorf AG | X50h | |
| 384-well low dead volume microplate Echo qualified | Beckman Coulter, Inc. | LP-0200 | |
| 6-well cell culture plates | Greiner Bio-One | 657 160 | Sterile with lid |
| Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X | Thermo Fisher Scientific | 15240-062 | |
| Cell counter | Thermo Fisher Scientific | Countess II FL | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 10566-016 | 500 mL |
| Echo acoustic liquid handler | Beckman Coulter, Inc. | Echo 550 | |
| Electronic multichannel pipette | Thermo Fisher Scientific | E1 ClipTip | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140-079 | 500 mL |
| HEPES buffer | Thermo Fisher Scientific | 15630-680 | 100 mL |
| InCell Pulse starter kit | Eurofins DiscoverX Corp. | 94-4007 | Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate |
| Microplate reader | Tecan Trading AG | Spark | |
| Single channel solution trough | Thermo Fisher Scientific | S253012005 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-010 | 100 mM |
| Thermal microplate sealer | Agilent Technologies, Inc. | PlateLoc | |
| Transfection reagents | Polyplus Transfection | jetPRIME | |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| TrypLE Express reagent | Thermo Fisher Scientific | 12605-010 | |
| Twin.tec 384 real-time PCR plates | Eppendorf AG | 30132734 |
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