JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Ricerca sul cancro

Hücresel Hedef Etkileşiminin SHP2 (PTPN11) Fosfataz Inhibitörleri ile Değerlendirilmesi

Published: July 17, 2020
doi:
10.3791/61457
, , , , ,
1Cancer Metabolism & Signaling Networks Program, NCI-Designated Cancer Center,Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute

Summary

Sağlam hücrelerde aday inhibitörleri tarafından hedef nişan değerlendirmek için yeteneği ilaç keşfi için çok önemlidir. Bu protokol, vahşi tip SHP2 veya onkojenik varyantlarını hedefleyen inhibitörlerin hücresel hedef etkileşimini güvenilir bir şekilde algılayan 384 iyi biçimli hücresel termal değişim testini tanımlar.

Abstract

PTPN11 proto-onkogen tarafından kodlanmış Src-homology 2 (SH2) etki alanı içeren fosfataz 2 (SHP2), hücre sağkalım ını ve çoğalmasını teşvik eden, reseptör tirozin kinaz (RTK) güdümlü hücre sinyalinin önemli bir aracısıdır. Buna ek olarak, SHP2 B ve T hücre aktivasyonunu inhibe etmek için bağışıklık kontrol noktası reseptörleri tarafından işe. Anormal SHP2 fonksiyonu birçok kanserin gelişimi, ilerlemesi ve metastazında yer almıştır. Nitekim, küçük molekül SHP2 inhibitörleri son ras / Raf / ERK yolu aktivasyonu ile katı tümörlerin tedavisi için klinik çalışmalara girmiştir, bazı onkojenik Ras mutasyonları ile tümörler de dahil olmak üzere. Ancak, SHP2 inhibitörlerinin mevcut sınıf lösemilerde sık görülen SHP2 onkojenik varyantlarına karşı etkili değildir ve onkojenik SHP2’yi hedefleyen spesifik küçük moleküllerin gelişimi güncel araştırmanın konusudur. SHP2 gibi sitosolik proteinleri içeren çoğu ilaç keşif kampanyaları ile ortak bir sorun, birincil tahliller bu sürücü kimyasal keşif genellikle in vitro tahliller aday bileşiklerin hücresel hedef nişan rapor yok olmasıdır. Hücresel hedef etkileşimini ölçmek için bir platform sağlamak için hem vahşi tip hem de mutant SHP2 hücresel termal değişim tahlilleri geliştirdik. Bu tahliller, hücrelerdeki SHP2 inhibitörlerinin hedef katılımını güvenilir bir şekilde algılar. Burada, SHP2 inhibitörlerinin değerlendirilmesi ve karakterizasyonu için değerli bir araç sağlayan bu testin kapsamlı bir protokolünü salıyoruz.

Introduction

Tirozin fosforilasyon hücrelerde sinyal transdüksiyon önemli bir rol oynar1,2. Bu post-translational modifikasyon protein tirozin kinazları (PtKs) tarafından katalize edilir ve protein tirozin fosfatazlar (PtPs) tarafından tersine çevrilir. Bu nedenle, anormal PTK veya PTP fonksiyonu birçok kalıtsal veya edinilmiş insan hastalıkları3yol açar,4,5,6. Src-homology 2 (SH2) etki alanı içeren fosfataz 2 (SHP2) yaygın olarak ifade edilen non-reseptör tipi PTP proto-oncogene PTPN117 tarafından kodlanmış ve Ras / Raf / ERK, PI3K / Akt veya JAK / STAT sinyal yollarıaktivasyonuile sinyal transdüksiyon içeren çok sayıda fizyolojik süreçlerin önemli bir düzenleyici 8 . Normalde, SHP2 aktivitesi anormal sinyalizasyonönlemek için sıkı bir şekilde düzenlenir. Bazal koşullar altında SHP2, katalitik fosfataz etki alanı içinde aktif bölgeye erişimi engelleyen N-terminal SH2 etki alanı tarafından otomatik olarak engellenir (Şekil 1A)9,10. Hücre aktivasyonu üzerine, tirozin fosforlu bağlayıcı proteinler SHP2’yi işe alır ve aktif alan artık alt tabakalarına erişebildiği aktif konformasyonunu benimsemesine neden olur. Birçok kanserde SHP2 aktivitesi yükselir. PTPN11’deki somatik fonksiyon kazanım (GOF) mutasyonları daha çok lösemilerde tespit edilmiştir ve N-SH2 etki alanının fosfataz etki alanına bağlanmasını önleyerek kurucu olarak aktif SHP2(Şekil 1B)11ile sonuçlanmıştır. PTPN11’deki Germline GOF mutasyonları Noonan sendromu olgularının ~%50’si, malignite riski yüksek bir gelişimsel bozukluktan sorumludur12. PTPN11 mutasyonlarının nadir olduğu solid tümörlerde, fosforilasyonlu bağlayıcı proteinlerin daha yüksek düzeyleri gelişmiş SHP2 aktivitesine yol açar(Şekil 1C). SHP2 de bağışıklık kontrol noktası sinyalizasyonu için önemlidir, BTLA veya PD-1 gibi kontrol noktası reseptörleri gibi anahtar sinyal molekülleri defosforilasyon için shp2 işe, bağışıklık hücresi aktivasyonunu önlemek13,14,15.

PtP’lerin aktif alanı yüksek oranda korunmuş ve yüksek oranda şarj edildiği için, PtP’lerin küçük moleküllerle hedeflanması zor olmuştur; aktif site hedef inhibitörleri genellikle güçlü, ama kötü seçicilik ve oral biyoyararlanım sergiler16,17,18,19,20,21,22.18 Nitekim, birçok rapor SHP2 inhibitörleri kötü seçicilik ve hücrelerde etkinlik eksikliği muzdarip23. Son zamanlarda, iyi potens ve mükemmel seçicilik ile SHP2 allosteric inhibitörleri bildirilmiştir (örneğin, SHP09924 ve RMC-455025)ve SHP2 inhibitörleri yenilenen ilgi yol açtı. Bileşikler SHP099 ve RMC-4550 dayalı şu anda faz I klinik çalışmalarda reseptör tirozin kinaz ile katı tümörleri tedavi etmek için (RTK) yolu aktivasyon26,27. Çığır açan iken, Bu bileşikler kan kanseri hastalarının önemli sayıda lökemogenez sürücü SHP2 onkojenik mutantların çoğuna karşıetkisizdir28,29,30. SHP2 onkojenik varyantlarına doğru SHP2 benzeri bileşiklerin bu potens eksikliği, SHP2 mutantlarında bozulan inaktif, kapalı konformasyonu bağlayarak ve stabilize ederek SHP2 aktivitesini inhibe ettikleri için, benzersiz allosterik mekanizmalarından kaynaklanmaktadır. Ayrıca, yeni bir rapora dayanarak31, SHP099 benzeri inhibitörleri ile tedavi hastalarda adaptif direnç mekanizmaları oldukça akla yatkındır. Sonuç olarak, aktif, açık durumunu hedefleyen yeni nesil SHP2 inhibitörlerinin geliştirilmesi yoğun bir araştırma konusudur.

Hücrelerde yeni SHP2 inhibitörlerinin karakterizasyonu kurşun optimizasyon sürecinin önemli bir yönüdür. Kritik, fizyolojik koşullar altında inhibitörü kanıtlanmış hedef nişan tıbbi kimya için kaynakların verimli verici hücresel etkinliği ile bileşikler üzerinde dağıtılan ek bir güven düzeyi sağlar. Geçmişte, küçük molekül inhibitörlerinin hedeflerine bağlanmasını değerlendirmek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir, öncelikle protein kinazları için32. Bir SHP2 hücresel hedef nişan analizi geliştirmek için, bir hücresel termal vardiya analizi33kullandı. Bu test, proteinler için in vitro termal shift benzer (PTS) test34, genellikle küçük moleküllerin bağlanması ile değiştirilir hedef protein termal stabilite, izler. Orijinal testi hedef protein düzeylerini ölçmek için antikorlar kullanan düşük bir iş testidir. Alternatif olarak, bir β-galaktosidaz enzim parça tamamlayıcılığı (EFC) analizi(Şekil 2)35kullanan termal kayma analizinin yakın zamanda bildirilen bir varyantını seçtik. Bu deneyler için, ilgi protein gelişmiş bir ProLabel etiketi taşıyan bir N- veya C-terminal füzyon proteini olarak hücrelerde ifade edilir (ePL, β-galaktosidaz bir 42 amino asit parçası). Hücreler daha sonra 384-iyi PCR uyumlu plakalar aktarılır ve ilgi bileşikleri ile kuluçkaya yatırılır. Bir termocycler proteinleri denature ve sıcaklık ısı stabilitesine bağlı olarak arttıkça agrega olacak hücrelere bir sıcaklık gradyan uygulamak için kullanılır. Bir aday bileşiğin ilgi proteinini bağlayıp stabilize edebilme yeteneği, o proteinin termal stabilitesinin artmasına neden olacaktır. Bu nedenle, hücrelerin lysis aşağıdaki, bir aday bileşik tarafından stabilize edilmiş bu etiketli proteinler araç kontrolü ile kuluçka hücrelerinetiketli proteinler daha yüksek sıcaklıklarda çözelti kalacaktır. Muhabir enzim kabul edici (EA) çözünür ePL etiketli proteinleri tamamlayarak, lüminesans substratı kullanılarak saptanabilir β-galaktosidaz aktivitesi ile sonuçlanır.

Yakın zamanda yabani tip SHP2 (SHP2-WT) ve sık shp2 onkojenik varyant (SHP2-E76K) için sağlam bir hücresel termal vardiya tayini geliştirdik minyatür leştirilmiş 384-iyiformat36. Burada, hücrelerdeki SHP2 inhibitörleri tarafından hedef etkileşimini güvenilir bir şekilde algılayan ve inhibitör potens ile hücresel termal değişim verileri arasında yüksek derecede korelasyon gösteren bu testin ayrıntılı bir protokolünü rapor ediyoruz. Genel titreiş akışı Şekil 3’tegösterilmiştir. Platformumuz n-terminally etiketli tam uzunlukta ePL-SHP2 füzyon proteinleri kullanır. İlgili pICP-ePL-N-SHP2-WT ve pICP-ePL-N-SHP2-E76K ifade plazmidleri üretimi için lütfen son yayın36bakın . Bu töz, SHP2 termal profillerini oluşturmak ve inhibitörün varlığında veya yokluğunda SHP2 erime sıcaklıklarını belirlemek için bir termal degrade kullanılarak gerçekleştirilebilir. Termal profiller kurulduktan sonra, aynı zamanda inhibisyon doz-yanıt değerlendirmesi sağlayan, izotermal koşullar altında yapılabilir. Her iki deney türü de aşağıda açıklanmıştır.

Protocol

1. Hücre kültürünün ve reaktiflerinin hazırlanması fetal sığır serumu, 1x antibiyotik/antimikotik, 20 mM HEPES ve 1 mM sodyum pirüuvat içeren 500 mL’lik bir büyüme ortamı şişesi formüle edin. 4 °C’de saklayın. Dondurulmuş orijinal stok şişelerinden hücresel termal kaydırma reaktiflerini (EA reaktifi, lisis tamponu ve substrat) eritin. Reaktifleri ve tamponu 2 mL aliquot olarak dağıtın ve -20 °C’de saklayın.NOT: Tekrarlanabilirlik için donma/çözülmede…

Representative Results

SHP2-WT için termal gradyan deneyi, katlanmış bir protein için tipik ve tutarlı olan dar bir erime geçişine sahip sigmoidal hücresel termal profille sonuçlandı(Şekil 4A). SHP2 üç bağımsız etki alanından oluşur: iki SH2 etki alanı ve katalitik etki alanı(Şekil 1). Otomatik inhibe kapalı konformasyon bu etki alanları kendi kendine ilişkilendirmek; Termal profil deneyinde gözlenen erime geçişi muhtemelen hücredeki bu durumu yansıtmaktad…

Discussion

Küçük moleküllerin hücrelerdeki SHP2 fosfatazına doğrudan bağlanmasını doğrulayabilecek bir hedef nişan analizi sunduk. Taht, düşük ve yüksek afisite inhibitörleri arasında ayrım yapabilir ve daha da önemlisi GOF onkojenik SHP2-E76K mutantı için SHP099 tipi allosterik inhibitörlerin potens eksikliğini doğrulayabilir. Bu minyatür leştirilmiş tayini bir gücü bir SHP2 inhibitörü tarama kampanyasına entegre edilebilir yeteneğidir. Tdenemenin bilinmeyen kimyasal madde ile SHP2’ye hücre içi …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma National Institutes of Health Grant 1R21CA195422 (L.T.’ ye), Epstein Aile Vakfı Ödülü (N.D. P. .C.) ve NCI Kanser Merkezi Destek Hibesi P30CA030199 tarafından desteklendi. Ayrıca, bu proje tamamen veya kısmen Ulusal Kanser Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Kimyasal Biyoloji Konsorsiyumu Sözleşme No altında Federal fonlar ile finanse edilmiştir. HHSN261200800001E. Bu yayının içeriği, Sağlık ve İnsan Iúletmeleri Bakanlığı’ nın görüşlerini veya politikalarını yansıtmadığı gibi, ticari adlardan, ticari ürünlerden veya kuruluşlardan bahsetmek DE ABD Hükümeti tarafından onaylandığı anlamına gelmez. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri’nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Materials

384-well gradient equipped thermocycler Eppendorf AG X50h
384-well low dead volume microplate Echo qualified Beckman Coulter, Inc. LP-0200
6-well cell culture plates Greiner Bio-One 657 160 Sterile with lid
Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X Thermo Fisher Scientific 15240-062
Cell counter Thermo Fisher Scientific Countess II FL
Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 10566-016 500 mL
Echo acoustic liquid handler Beckman Coulter, Inc. Echo 550
Electronic multichannel pipette Thermo Fisher Scientific E1 ClipTip
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 26140-079 500 mL
HEPES buffer Thermo Fisher Scientific 15630-680 100 mL
InCell Pulse starter kit Eurofins DiscoverX Corp. 94-4007 Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate
Microplate reader Tecan Trading AG Spark
Single channel solution trough Thermo Fisher Scientific S253012005
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11360-010 100 mM
Thermal microplate sealer Agilent Technologies, Inc. PlateLoc
Transfection reagents Polyplus Transfection jetPRIME
Trypan blue Thermo Fisher Scientific T10282
TrypLE Express reagent Thermo Fisher Scientific 12605-010
Twin.tec 384 real-time PCR plates Eppendorf AG 30132734
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Hunter, T. Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting. Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).
  2. Alonso, A., et al. Protein tyrosine phosphatases in the human genome. Cell. 117 (6), 699-711 (2004).
  3. Cohen, P. Protein kinases-the major drug targets of the twenty-first century. Nature Reviews Drug Discovery. 1 (4), 309 (2002).
  4. Ferguson, F. M., Gray, N. S. Kinase inhibitors: the road ahead. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (5), 353-377 (2018).
  5. Stanford, S. M., Bottini, N. Targeting Tyrosine Phosphatases: Time to End the Stigma. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (6), 524-540 (2017).
  6. Tonks, N. Protein tyrosine phosphatases–from housekeeping enzymes to master regulators of signal transduction. FEBS Journal. 280 (2), 346-378 (2013).
  7. Chan, R., Feng, G. PTPN11 is the first identified proto-oncogene that encodes a tyrosine phosphatase. Blood. 109 (3), 862-867 (2007).
  8. Chan, G., Kalaitzidis, D., Neel, B. The tyrosine phosphatase Shp2 (PTPN11) in cancer. Cancer Metastasis Rev. 27 (2), 179-192 (2008).
  9. Hof, P., Pluskey, S., Dhe-Paganon, S., Eck, M., Shoelson, S. Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2. Cell. 92 (4), 441-450 (1998).
  10. Barford, D., Neel, B. Revealing mechanisms for SH2 domain mediated regulation of the protein tyrosine phosphatase SHP-2. Structure. 6 (3), 249-254 (1998).
  11. Neel, B. G., Chan, G., Dhanji, S. . Handbook of Cell Signaling (Second Edition). 2, 771-809 (2010).
  12. Tartaglia, M., et al. Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome. Nature Genetics. 29 (4), 465-468 (2001).
  13. Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
  14. Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (24), 13866-13871 (2001).
  15. Watanabe, N., et al. BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA-4 and PD-1. Nature Immunology. 4 (7), 670-679 (2003).
  16. Bialy, L., Waldmann, H. Inhibitors of protein tyrosine phosphatases: next-generation drugs. Angewandte Chemie International Edition England. 44 (25), 3814-3839 (2005).
  17. Kumar, S., Liang, F., Lawrence, D., Zhang, Z. Small molecule approach to studying protein tyrosine phosphatase. Methods. 35 (1), 9-21 (2005).
  18. Tautz, L., Pellecchia, M., Mustelin, T. Targeting the PTPome in human disease. Expert Opinion in Thereapeutics Targets. 10 (1), 157-177 (2006).
  19. Tautz, L., Mustelin, T. Strategies for developing protein tyrosine phosphatase inhibitors. Methods. 42 (3), 250-260 (2007).
  20. Vintonyak, V., Antonchick, A., Rauh, D., Waldmann, H. The therapeutic potential of phosphatase inhibitors. Current Opinion in Chemical Biology. 13 (3), 272-283 (2009).
  21. Barr, A. Protein tyrosine phosphatases as drug targets: strategies and challenges of inhibitor development. Future Medicinal Chemistry. 2 (10), 1563-1576 (2010).
  22. He, R., Zeng, L., He, Y., Zhang, S., Zhang, Z. Small molecule tools for functional interrogation of protein tyrosine phosphatases. FEBS Journal. 280, 731-750 (2012).
  23. Tsutsumi, R., Ran, H., Neel, B. G. Off-target inhibition by active site-targeting SHP2 inhibitors. FEBS Open Biology. 8 (9), 1405-1411 (2018).
  24. Chen, Y. N., et al. Allosteric inhibition of SHP2 phosphatase inhibits cancers driven by receptor tyrosine kinases. Nature. 535 (7610), 148-152 (2016).
  25. Nichols, R. J., et al. RAS nucleotide cycling underlies the SHP2 phosphatase dependence of mutant BRAF-, NF1- and RAS-driven cancers. Nature Cell Biology. 20 (9), 1064-1073 (2018).
  26. . Clinical Trial NCT03114319 Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1 (2019)
  27. . Clinical Trial NCT03634982 Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1 (2019)
  28. Sun, X., et al. Selective inhibition of leukemia-associated SHP2(E69K) mutant by the allosteric SHP2 inhibitor SHP099. Leukemia. 32 (5), 1246-1249 (2018).
  29. LaRochelle, J. R., et al. Structural reorganization of SHP2 by oncogenic mutations and implications for oncoprotein resistance to allosteric inhibition. Nature Communication. 9 (1), 4508 (2018).
  30. Padua, R. A. P., et al. Mechanism of activating mutations and allosteric drug inhibition of the phosphatase SHP2. Nature Communication. 9 (1), 4507 (2018).
  31. Lu, H., et al. Resistance to allosteric SHP2 inhibition in FGFR-driven cancers through rapid feedback activation of FGFR. Oncotarget. 11 (3), 265-281 (2020).
  32. Smyth, L. A., Collins, I. Measuring and interpreting the selectivity of protein kinase inhibitors. Journal of Chemical Biology. 2 (3), 131-151 (2009).
  33. Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
  34. Ericsson, U., Hallberg, B., Detitta, G., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
  35. McNulty, D. E., et al. A High-Throughput Dose-Response Cellular Thermal Shift Assay for Rapid Screening of Drug Target Engagement in Living Cells, Exemplified Using SMYD3 and IDO1. SLAS Discovery. 23 (1), 34-46 (2018).
  36. Romero, C., et al. A cellular target engagement assay for the characterization of SHP2 (PTPN11) phosphatase inhibitors. Journal of Biological Chemistry. 295 (9), 2601-2613 (2020).
  37. Ran, H., Tsutsumi, R., Araki, T., Neel, B. G. Sticking It to Cancer with Molecular Glue for SHP2. Cancer Cell. 30 (2), 194-196 (2016).

Tags

SHP2PhosphataseCell SignalingCancer TherapySmall Molecule InhibitorsTarget EngagementCell-based AssayHEK293 T-cellsTransfection384-well PlatesLiquid Handling
check_url/it/61457?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Lambert, L. J., Romero, C., Sheffler, D. J., Celeridad, M., Cosford, N. D. P., Tautz, L. Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors. J. Vis. Exp. (161), e61457, doi:10.3791/61457 (2020).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image