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Articolo metodologico

Un modello murino di esposizione fetale all'infiammazione materna per studiare gli effetti della corioamionite acuta sullo sviluppo intestinale appena nato

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DOI:

10.3791/61464

⸱

24 giugno 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Neonatology, Stead Family Department of Pediatrics, University of Iowa, 2Division of Maternal Fetal Medicine, Department of Obstetrics & Gynecology, University of Iowa, 3Division of Neonatology, Department of Pediatrics, Vanderbilt University, 4Department of Microbiology & Immunology, University of Iowa

In questo articolo

Sommario

Abbiamo sviluppato un modello di corioamionite per simulare l'esposizione fetale all'infiammazione materna (FEMI) senza complicazioni di organismi vivi per esaminare gli effetti del FEMI sullo sviluppo del tratto intestinale della prole. Ciò consente lo studio delle cause meccaniche per lo sviluppo di lesioni intestinali a seguito della corioamionite.

Abstract

La corioamionite è un precipitante comune di nascita pretermine ed è associata a molte delle morbilità della prematurità, inclusa l'enterocolite necrotizzante (NEC). Tuttavia, un legame meccanicistico tra queste due condizioni rimane ancora da scoprire. Abbiamo adottato un modello murino di corioamnionite che coinvolge l'esposizione fetale indotta dal lipoppiosaccaride (LPS) all'infiammazione materna (FEMI). Questo modello di FEMI induce una cascata infiammatoria sterile materna, placentare e fetale, che è presente anche in molti casi di corioamionite clinica. Sebbene esistano modelli che utilizzano batteri vivi e imitano più accuratamente la fisiopatologia di un'infezione ascendente con conseguente corioamionite, questi metodi possono causare effetti indiretti sullo sviluppo del tratto intestinale immaturo e del microbioma in via di sviluppo associato. Utilizzando questo protocollo, abbiamo dimostrato che il FEMI indotto dall'LPS si traduce in un aumento dose-dipendente della perdita della gravidanza e della nascita pretermine, nonché in interruzione del normale sviluppo intestinale nella prole. Inoltre, abbiamo dimostrato che il FEMI aumenta significativamente la lesione intestinale e le citochine siere nella prole, riducendo contemporaneamente calice e cellule di Paneth, entrambe forniscono una prima linea di immunità innata contro l'infiammazione intestinale. Sebbene un modello simile di FEMI indotto dall'LPS sia stato utilizzato per modellare l'associazione tra corioamionite e successive anomalie del sistema nervoso centrale, a nostra conoscenza, questo protocollo è il primo a tentare di chiarire un legame meccanicistico tra corioamionite e successive perturbazioni nello sviluppo intestinale come potenziale legame tra corioamninite e NEC.

Introduzione

Le membrane corioniche svolgono un ruolo fondamentale nella gravidanza dei mammiferi. Includono il chorion e l'amnion, che servono più funzioni. Circondano e proteggono il feto, facilitano la segnalazione paracrina tra i compartimenti materno efetale 1e creano anelli di feedback locali all'interno delle membrane corioniche, che possono essere coinvolti nell'avvio della parto1. La comprensione attuale delle membrane indica che l'amnione fornisce una funzione di barriera strutturale e il corione fornisce un buffer immunologico principalmente per proteggere il feto in via di sviluppo dal sistema immunitariomaterno 2. L'infiammazione di queste membrane è nota come corioamionite. Storicamente, la diagnosi di corioamionite clinica è stata fatta in seguito alla presenza di febbre materna più uno o più risultati clinici fetali omaterni 3,4. Tuttavia, sebbene questa definizione sia clinicamente utile, la sua mancanza di precisione ha reso difficile la ricerca sulla corioamionite. Nel 2015, nel tentativo di chiarire la diagnosi, un workshop del gruppo di esperti dell'Eunice Kennedy Shriver National Institute for Child Health and Human Development ha definito la corioamniionite come infiammazione intrauterina, o infezione, o entrambi (tripla I)3. Questo chiarimento è importante perché mentre l'infezione indotta microbica è una causa importante di infiammazione uterina / amniotica, si verifica meno comunemente dell'infiammazione uterina / amniotica sterile5,6,7. Nel complesso, la corioamniionite rimane un problema significativo di salute pubblica, come si vede nel 2\u20124% delle consegne a termine e nel 25\u201230% delle consegne pretermine8,9.

La corioamionite può avere effetti significativi sul feto e sul neonato. È stato ben documentato in letteratura che la corioamionite è associata ad un aumento del rischio di molte delle morbilità della prematurità, tra cui la displasia broncopolmonare10,la lesione cerebrale della materia bianca11,l'emorragia intraventricolare12,la retinopatia della prematurità13e la sepsi neonatale ad esordio precoce sospetta e confermata14,15. Poiché siamo interessati a meccanismi di lesione e riparazione del tratto intestinale immaturo, è importante notare che la corioamniionite è anche associata a un successivo sviluppo di enterocolite necrotizzante (NEC)15,16. Il NEC è una devastante malattia gastrointestinale dei neonati pretermine che si traduce in una risposta dell'ospite disregolata all'infiammazione e alla successiva necrosiintestinale 17. Ogni anno, il NEC colpisce oltre 4000 neonati negli Stati Uniti e fino a un terzo di questi neonati muore a causa della malattia18. La patogenesi del NEC probabilmente comporta una combinazione di immaturità intestinale, disregolazione del sistema immunitario immaturo, infiammazione intestinale e traslocazionebatterica 19, che culmina in un ultimo percorso comune di necrosi intestinale. È importante sottolineare che l'insorgenza del NEC si verifica spesso settimane dopo la nascita e la potenziale esposizione alla corioamionite, rendendo poco chiaro il legame meccanicistico tra corioamniionite e successivo sviluppo del NEC20. Un potenziale meccanismo con cui la corioammintite può contribuire alla fisiopatologia del NEC è attraverso l'upregolazione del sistema immunitario materno, producendo successivamente una forte risposta infiammatoria fetale che può interrompere i normali modelli di sviluppofetale 21,22,23.

Nei roditori e nelle pecore esistono più modelli di corioamionite di mammiferi24,25,26,27,28,29,30,31,32. Tuttavia, esistono pochi dati relativi allo sviluppo del tratto intestinale oltre il periodo iniziale appena nato a seguito dell'esposizione fetale indotta dalla corioamnite all'infiammazione materna (FEMI). Al fine di esplorare la relazione tra il FEMI e il successivo sviluppo della lesione del tratto intestinale immaturo, abbiamo adattato il modello FEMI indotto dal lipoppiosaccaride (LPS). I lipopatolisaccaridi sono un componente importante della superficie extracellulare sui batteri gram negativi e sono un potente stimolante del sistema immunitario innato di più specie eucariotiche, compresi gli esseriumani 33. L'iniezione materna di LPS si traduce in una cascata infiammatoria sterile senza gli effetti confondenti dei batteri vivi, ed è un modello ben consolidato per l'induzione della nascita pretermine34, così come un modello di corioamionite acuta e la sindrome da risposta infiammatoria fetale (FIRS), che è la forma più grave di corioamniionite24,35. È stato anche dimostrato che induce lesioni cerebrali di materia bianca e grigia in una pecora modello36 e un murino modello37,38,39,40. Tuttavia, per quanto ne sappiamo, siamo i primi a utilizzare questo modello di corioamionite e FEMI per indagare i suoi effetti sullo sviluppo del tratto gastrointestinale dopo la nascita, nonché per indagare un possibile legame meccanicistico tra corioamionite e successivo sviluppo di NEC41,42.

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Protocollo

Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università dell'Iowa (Protocol #8041401). Tutti gli animali sono stati ospitati in un vivarium approvato dall'Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AALAC) presso l'Università dell'Iowa. Tutti i topi erano ceppo di tipo selvatico C57Bl/6J.

1. Istituzione del FEMI nei topi gravidi

  1. Preparazione LPS
    1. Utilizzare LPS derivato da Escherichia coli O55:B5 (concentrazione di scorte 2 mg/mL).
    2. Diluire la concentrazione di materiale LPS 1:100 con salina sterile per una concentrazione di lavoro di 20 μg/mL.
  2. Iniezione materna di LPS
    1. Iniettare dighe gravide al giorno di gestazione e15. Questo punto di tempo è di circa il 75% attraverso la gravidanza murina, rendendo questo modello simile allo sviluppo del terzo trimestre precoce delle gravidanze umane, che è quando si verifica la maggior parte delle nascite pretermine a causa della corioamionite.
    2. Pesare i topi gravidi immediatamente prima dell'iniezione per determinare il dosing LPS appropriato.
    3. Calcolare la dose di concentrazione di lavoro utilizzando la seguente formula: 5 μL x grammo di peso corporeo (gbw), per una dose totale di LPS di 100 μg/kg. Per controllare gli animali, utilizzare un volume equivalente di soluzione salina normale per iniezione.
    4. Soluzione Vortex LPS tre volte per 15 secondi in altezza prima di ogni iniezione.
    5. Redigere il volume LPS in una siringa da 1 ml.
    6. Trattenere il topo incinta con la tecnica dello scruffing. Tenere premuto in posizione di reclinamento dorsale ed eseguire l'iniezione.
      1. Inserire un ago da 30 gauge da 8 mm che si smussa sovrascriva il quadrante inferiore destro dell'addome (per evitare vesciche e vasi addominali) con un angolo di 30\u201240°. Inserire circa 1/4 a 1/2 della lunghezza dell'ago.
      2. Tirare indietro sullo stantuffo della siringa per garantire una pressione negativa prima dell'iniezione. Procedere con l'iniezione se è presente una pressione negativa.
      3. Dopo l'iniezione, monitorare i topi per circa 30 minuti e quindi tornare in gabbia per il resto della gravidanza.

2. Consegna e cura della prole e raccolta intestinale

  1. Consegnare i cuccioli normalmente tramite parto vaginale a e20.
    NOTA: Questo modello ha un tasso di perdita fetale dose-dipendente previsto che può essere visto nella figura 1 ed è discusso nei risultati seguenti.
  2. Consenti ai cuccioli di rimanere con le madri e ricevere mangimi ad libitum.
  3. Il giorno della raccolta, tipicamente postnatale giorno 14 (P14), eutanasia i cuccioli tramite lussazione cervicale in conformità con i protocolli del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.
  4. Usando forbici e forcette, fai un'incisione verticale lungo la linea mediana dell'addome, attraverso la pelle e il peritoneo, per l'intera lunghezza dell'addome. Asportare l'intestino tenue dallo stomaco al cieco con le forbici e rimuovere il mesentere con le forcep.
  5. Isolare e mantenere il distale 1/3 dell'intestino tenue (sezione rappresentativa dell'ileo umano), scartando l'intestino tenue prossimale, il cieco e il colon.
  6. Dividere la porzione di ileo a metà usando le forbici.
  7. Posizionare la metà prossimale in una soluzione di stabilizzazione dell'RNA per una successiva quantificazione dell'RNA.
  8. Posizionare la metà distale in formalina tamponata neutra al 10% per la preparazione dello scivolo.

3. Punteggio lesioni intestinali

  1. Sezionare il tessuto incorporato di paraffina in fette spesse 5 μm e montare su vetrini.

    NOTA: Inviamo gli esemplari a un nucleo istologico per l'incorporamento, la sessatura e il montaggio di paraffina su diapositive.
  2. Deparaffinizzare le diapositive secondo procedure standard.
  3. Sezioni di macchie con ematossilina ed eosina secondo procedure standard.
  4. Partitura di sezioni su una scala a 3 punti per lesioni intestinali come descrittoin precedenza 42,43.
    1. Utilizzando la microscopia ottica, valutare la lesione intestinale generalizzata da parte di due investigatori accecati separati su una scala a 3 punti che valuta l'integrità del villus e la separazione dalla membranabasale 43 (Figura complementare 1). La lesione intestinale è valutata al meglio con ingrandimento 20x e apertura numerica 0,50.
    2. Assegnare un punteggio di 0 per descrivere la mucosa normale.
    3. Assegnare un punteggio di 1 descrivere lesioni lievi che comprendono lo sviluppo dello spazio subepiteliale di Gruenhagen, la vacuolizzazione o il sollevamento subepiteliale limitato alla lamina propria o alle punte dei villi.
    4. Assegnare un punteggio di 2 per descrivere lesioni gravi, indicate dal sollevamento epiteliale e dalla vacuolizzazione superiore alla metà dei villi, distorsione villi o ulcerazione mucosa e disintegrazione della lamina propria.

4. Quantificazione delle cellule di Paneth e calice

  1. A seguito della deparaffinizzazione, le diapositive di macchie di sezioni tissutali del passaggio 2.8 con macchia di Schiff blu/acido periodico alciano per indicare sia il calice che le cellule di Panethcome descritto in precedenza 44,45 secondo i seguenti passaggi.
    NOTA: Mentre la macchia di Schiff alcian Blue /Periodic Acid non è specifica né per le cellule paneth né per le cellule di calice, nella nostra esperienza, gli investigatori esperti accecati hanno una quantificazione cellulare equivalente utilizzando questa macchia rispetto agli anticorpi mirati cellulari, con una colorazione di fondo significativamenteinferiore 46.
  2. Deparaffinizzare, macchiare e disidratare le diapositive come segue.
    1. Immergere gli scivoli in xilene per 10 minuti due volte.
      ATTENZIONE: Lo xilene deve essere usato in una cappa aspirante.
    2. Risciacquare con EtOH al 100%.
    3. Immergere le diapositive in EtOH al 100 % per 3 minuti, quindi in EtOH al 90% per 3 minuti, seguite da EtOH al 70% per 3 minuti, e infine immergere le diapositive nel 50% di EtOH per 3 minuti.
    4. Lavare sotto l'acqua corrente del rubinetto per 5 minuti.
      ATTENZIONE: Puntaree la sezione dall'acqua corrente per evitare la perdita del campione di tessuto.
    5. Filtrare la soluzione di macchia blu alciana con un filtro da caffè standard.
    6. Le macchie scivolano nella macchia blu alciana per 15 minuti e quindi lavano sotto l'acqua corrente del rubinetto per 2 minuti.
    7. Diluire 1 mg di acido periodico in 200 mL di acqua distillata doppia. Immergere le diapositive in questa soluzione per 5 minuti. Quindi lavare sotto l'acqua corrente del rubinetto per 1 minuto.
    8. Macchiare con il reagente di Schiff per 10 minuti. Lavare sotto l'acqua corrente del rubinetto per 5 minuti.
    9. Colla gli scivoli con ematossilina per 1 minuto e quindi lavare sotto l'acqua corrente del rubinetto per 2 minuti.
    10. Immergerli nell'alcole acido (1 mL di acido cloridrico miscelato in 99 mL del 70% di EtOH) per 1 min.
    11. Immergere nell'acqua del rubinetto di Scott (concentrazione dello 0,1% di NaHCO3 nell'acqua del rubinetto) per 1 minuto e quindi lavare sotto l'acqua corrente del rubinetto per 1 minuto.
    12. Disidratare le diapositive.
      1. Immergere ogni diapositiva 10 volte in 70% EtOH, quindi immergere 10 volte in 90% EtOH e 10 volte in EtOH al 100%.
      2. Immergere le diapositive in EtOH al 100% per 10 minuti, seguite da immergersi due volte in xilene fresco per 3 minuti ciascuna.
    13. Posizionare una goccia di supporto di montaggio sul campione e posizionare una coverlip su di esso.
  3. Conteggio delle celle di Calice
    1. Utilizzando la microscopia ottica, contare le cellule del calice (Figura complementare 2). Per ogni pezzo di tessuto intestinale, contare il numero di cellule calici e 500 cellule epiteliali e esprimere il rapporto cellulare del calice come rapporto per 100 cellule epiteliali. Le celle di calice sono conteggiate al meglio con ingrandimento 20x e apertura numerica 0,5.
  4. Conteggio delle celle di Paneth
    1. Utilizzando la microscopia ottica, contare le celle di Paneth (Figura complementare 2). Per ogni pezzo di tessuto intestinale, esprimere come un rapporto di cellule paneth per cripta intestinale. Conta 100 cripte intestinali per ogni pezzo di tessuto intestinale. Le celle paneth sono conteggiate al meglio con ingrandimento 20x-60x e apertura numerica 0,50-1,30.

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Risultati

L'esposizione al FEMI il giorno 15 embrionale porta ad una perdita di gravidanza dose-dipendente e ad un'intensità dose-dipendente di lavoro pretermine (Figura 1)42. Per gli esperimenti, abbiamo scelto di utilizzare una dose LPS di 100 μg /kg per ridurre al minimo la perdita di gravidanza e la prematurità (perdita del 50% sia tra prematurità che per scomparsa fetale intrauterina) esponendo i feti a un significativo insulto infiammatorio.

Ut...

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Discussione

La corioamniionite ha un impatto sul 2\u20124% del termine e sul 25\u201230% delle consegne pretermine8,9. Tuttavia, l'impatto della corioamionite può estendersi a lungo oltre la nascita in quanto ha dimostrato di avere effetti significativi sul feto e sul neonato10,11,12,13,14,

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto in parte attraverso il National Institutes of Health (DK097335 & T32AI007260) e il Dipartimento di Pediatria della Famiglia Stead dell'Università dell'Iowa.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Formalina tamponata neutra al 10%SigmaHT501128
colorazione blu AlcianFornitura nuovi arrivati1003A
C57Bl6/J topiJackson Laboratories664
EthanolDecon labs2701
HClSigmaH1758
Colorazione ematossilinaLeica381562
LPSSigmaL2880
NaHCO3SigmaS6014
Nikon Eclipse Ni-U MicroscopioNikon2CE-MQVJ-1
Acido periodicoACROSH5106CAS # 10450-59-9
RNAlaterThermofisherAm7021
Reagente di SchiffSigmaS5133
Secor Imager 2400Scoperta su scala meso (MSD)Saggio
V-PlexScoperta su scala meso (MSD)
XileneSigma534056

Riferimenti

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