استراتيجية phosphoproteomic لتوصيف الإشارات الإجهاد التناضح في arabidopsis
Summary
قدمت هنا هو نهج phosphoproteomic، وهي وقف والذهاب تلميح استخراج القائمة على phosphoproteomic، الذي يوفر إنتاجية عالية وتغطية عميقة من phosphoproteome Arabidopsis. يحدد هذا النهج نظرة عامة على إشارات الإجهاد التناضح في Arabidopsis.
Abstract
إن فسفورة البروتين أمر حاسم لتنظيم نشاط الإنزيم والتعبير الجيني في ظل حالة تناضحة. وقد حولت قياس الطيف الكتلي (MS) القائم على الفوسفاتية على أساس phosphoproteomics طريقة دراسة عملية تحويل إشارة النبات. ومع ذلك، كان شرط الكثير من المواد الأولية وإطالة وقت قياس التصلب المتعدد لتحقيق عمق التغطية هو العامل المقيد لدراسة الإنتاجية العالية للتغيرات الفوسفوبروتينية العالمية في النباتات. لتحسين حساسية وإنتاجية phosphoproteomics النبات، وضعنا توقف والذهاب استخراج (مرحلة) تلميح نهج يستند phosphoproteomics إلى جانب تاند ماس الوسم (TMT) وضع العلامات للتحليل السريع والشامل لزعزعة الفوسوبيل النباتية استجابة للإجهاد التناضح. الاستفادة من البساطة وارتفاع الإنتاجية من تقنية تلميح المرحلة، الإجراء كله يأخذ ما يقرب من ساعة واحدة باستخدام اثنين من النصائح لإنهاء إثراء فوسفوبيبيتيد، تجزئة، وخطوات التنظيف عينة، مما يشير إلى سهولة الاستخدام والكفاءة العالية للنهج. وهذا النهج لا يوفر فقط تحليل phosphoproteomics النباتية المتعمقة (> 11000 تعريف فوسببتيد) ، بل يوضح أيضا كفاءة الفصل الفائقة (< 5 ٪ تداخل) بين الكسور المجاورة. علاوة على ذلك ، تم تحقيق تعدد التعدد باستخدام تسمية TMT لتحديد التغيرات الفوسفاتيةبروتينية للنباتات المتحولة من النوع البري وsnrk2 decuple. وقد استخدم هذا النهج بنجاح للكشف عن أحداث الفوسفور من كينازات تشبه راف استجابة للإجهاد التناضحي ، الذي يلقي الضوء على فهم الإشارات التناضحية المبكرة في مصانع الأرض.
Introduction
ارتفاع الملوحة، وانخفاض درجة الحرارة، والجفاف يسبب الضغوط التناضحة، وهو عامل بيئي رئيسي يؤثر على إنتاجية النبات1،2. إنّ فسفورة البروتين هي واحدة من أهم التعديلات اللاحقة للوساطة في إدراك الإشارة و تحويلها في استجابة النبات للإجهاد التناضحي3،4،5. SNF1 البروتين ذات الصلة كيناز 2s (SnRK2s) وتشارك في الإجهاد التناضح إشارة6. تسعة من عشرة أعضاء من عائلة SnRK2 تظهر تفعيل كبير في استجابة للإجهاد التناضحي7,8. وsnrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple(snrk2-dec)متحولة وجود الطفرات في كل عشرة SnRK2 عرض فرط الحساسية للإجهاد التناضحي. في snrk2-dec mutant, تراكم التناسخ الناجم عن الإجهاد من إينوزيتول 1,4,5-trisphosphate (IP3),حمض abscisic (ABA) التركيب الحيوي, ويتم تخفيض التعبيرات الجينية بقوة, تسليط الضوء على الدور الحيوي لSnRK2s في استجابات الإجهاد osmotic6. ومع ذلك، فإنه لا يزال من غير الواضح كيف ينظم kinases SnRK2s هذه العمليات البيولوجية. إن تحديد ملامح التغيرات الفوسفاتية في مجال بروتونات الفوسفو في استجابة للإجهاد التناضحيي هو وسيلة فعالة لسد هذه الفجوة وتحديد آليات الدفاع التي تسببها الاجهاد في النباتات.
قياس الطيف الشامل (MS) هو تقنية قوية لرسم خرائط مصنع الفوسفاتproteome9. ومع ذلك، يظل توصيف الفوسبروتينات النباتية يمثل تحديًا بسبب المدى الديناميكي للبروتيوم النباتي ومدى تعقيد الفلورات النباتية4. للتغلب على هذه التحديات، وضعنا سير عمل نباتي شامل للفوسفوبروتينات، والذي يزيل التداخلات غير المرغوب فيها مثل الأصباغ الضوئية والإيضات الثانوية، وتمكين التغطية العميقة للفوسفوبروتينوم النباتي10. وقد تم تطوير عدة طرق تخصيب فوسفوسوبيبتيد مثل شل الحركة المعدنية أيونات اللوني (IMAC) وكلوروغرافيا أكسيد المعادن (MOC) لإثراء فوسفوسوبيبتيد قبل تحليل MS11،12،13،14،15،16. حمضية غير فوسفوسوبيبتيدات شارك تنقية مع فوسفوسوبيبتيد هي التدخلات الرئيسية للكشف عن فوسفوسوبيبتيد. سابقا، ونحن موحدة قيمة الرقم الحموضة وتركيز حمض عضوي من IMAC تحميل العازلة للقضاء على ربط غير فوسفوسوبيبتيد، للحصول على أكثر من 90٪ خصوصية التخصيب تجاوز الخطوة ما قبل التجزئة11.
فقدان العينة في عملية متعددة الخطوات من إثراء فوسوبيبتيد وتجزئة يعوق حساسية تحديد فوسفوبيبتيد وعمق التغطية فوسفوبروتينومي. نصائح التوقف والذهاب الاستخراج (نصائح المرحلة) هي نصائح ماصة التي تحتوي على أقراص صغيرة لسقف نهاية الطرف، والتي يمكن دمجها مع الكروماتوغرافيا لتجزئة الببتيد وتنظيف17. يمكن تقليل فقدان العينة أثناء إجراء طرف المرحلة عن طريق تجنب نقل العينة بين الأنابيب. لقد نفذنا بنجاح المرحلة تلميح في Ga3 +– IMAC و Fe3 +– IMAC لفصل منخفضة وفيرة متعددة الببتيدات الفوسفورية من الببتيدات الفوسفورية منفردة، والتي حسنت عمق phosphoproteome الإنسان15. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام درجة عالية من درجة السوية عكس المرحلة (Hp-RP) وقد أظهرت المرحلة تلميح التغطية الأوسع للبروتيوم غشاء الإنسان مقارنة مع ذلك من تبادل الموجبة قوية (SCX) وتبادل الأنيون قوية (ساكس) الكروماتوغرافيا18. ولذلك، يمكن دمج IMAC وHP-RP المرحلة تقنيات تلميح زيادة تغطية phosphoproteome النبات مع البساطة، وخصوصية عالية، وإنتاجية عالية. لقد أثبتنا أن هذه الاستراتيجية حددت أكثر من 20،000 مواقع الفسفور من شتلات Arabidopsis ، مما يمثل عمق محسن من phosphoproteome النبات19.
هنا، ونحن تقرير المرحلة البقشيش بروتوكول الفوسفاتية القائمة على phosphoproteomic للتوصيف الفوسفاتيبروتيني في Arabidopsis. تم تطبيق هذا العمل لدراسة الانزعاج الفوسفاتيبروتومي من نوع البرية وsnrk2 ديسمبر الشتلات متحولة استجابة للإجهاد التناضح. وكشف تحليل phosphoproteomic مواقع الفوسفور المتورطين في تنشيط كيناز وإشارات الإجهاد التناضحي في وقت مبكر. تحليل مقارن من نوع البرية وsnrk2 ديسمبر بيانات phosphoproteome متحولة أدى إلى اكتشاف كيناز مثل راف (RAF) – SnRK2 سلسلة كيناز التي تلعب دورا رئيسيا في إشارات الإجهاد osmore في النباتات العالية.
Protocol
Representative Results
Discussion
لا يزال النطاق الديناميكي وتعقيد بروتين النبات والفوسفوبروتينيوم عاملاً مقيداً لعمق تحليلات الفوسفاتبروتينيوم. على الرغم من قدرة واحدة تشغيل LC-MS/MS تحليل لتحديد 10,000 مواقع الفوسفور21,22, لا تزال محدودة التغطية من phosphoproteome النبات كله. ولذلك، فإن سير العمل phosphopr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل برنامج البحوث ذات الأولوية الاستراتيجية للأكاديمية الصينية للعلوم، Grant XDB27040106.
Materials
| 1.5 mL tube | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes |
| 200 µL pipet tip | Gilson | F1739311 | |
| 2-chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| ammonium phosphate monbasic | Sigma-Aldrich | 216003 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| blunt-ended needle | Hamilton | 90516 | Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16 |
| C18-AQ beads | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µm | |
| C8 Empore disk | 3 M | 2214 | 47 mm |
| Centrifuge | eppendorf | 22620444 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | CX1058 | |
| data analysis software | Perseus 1.6.2.1 | https://maxquant.net/perseus/ | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid | Sigma-Aldrich | 5330020050 | |
| Frits | Agilent | 12131024 | Frits for SPE Cartridges |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | |
| H2O | Sigma-Aldrich | 1153334000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| LTQ-orbitrap | Thermo Fisher Scientific | Velos Pro | |
| mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | LTQ-Orbitrap Velos Pro | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| nano LC | Thermo Fisher Scientific | Easy-nLC 1000 | |
| Ni-NTA spin column | Qiagen | 31014 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| plunger | Hamilton | 1122-01 | Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 μl) |
| search engine software | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
| SEP-PAK Cartridge 50 mg | Waters | WAT054960 | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SPD121P | |
| TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Triethylammonium bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 |
Riferimenti
- Hasegawa, P. M., Bressan, R. A., Zhu, J. K., Bohnert, H. J. Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annual Review Plant Physiology Plant Molecualr Biology. 51, 463-499 (2000).
- Janmohammadi, M., Zolla, L., Rinalducci, S. Low temperature tolerance in plants: Changes at the protein level. Phytochemistry. 117, 76-89 (2015).
- Umezawa, T., Takahashi, F., Shinozaki, K. Phosphorylation networks in the abscisic acid signaling pathway. Enzymes. 35, 27-56 (2014).
- Silva-Sanchez, C., Li, H., Chen, S. Recent advances and challenges in plant phosphoproteomics. Proteomics. 15 (5-6), 1127-1141 (2015).
- Wang, P., et al. Mapping proteome-wide targets of protein kinases in plant stress responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (6), 3270-3280 (2020).
- Fujii, H., Verslues, P. E., Zhu, J. K. Arabidopsis decuple mutant reveals the importance of SnRK2 kinases in osmotic stress responses in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1717-1722 (2011).
- Wang, P., et al. Quantitative phosphoproteomics identifies SnRK2 protein kinase substrates and reveals the effectors of abscisic acid action. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (27), 11205-11210 (2013).
- Boudsocq, M., Barbier-Brygoo, H., Lauriere, C. Identification of nine sucrose nonfermenting 1-related protein kinases 2 activated by hyperosmotic and saline stresses in Arabidopsis thaliana. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41758-41766 (2004).
- Li, J., Silva-Sanchez, C., Zhang, T., Chen, S., Li, H. Phosphoproteomics technologies and applications in plant biology research. Frontiers in Plant Science. 6, 430 (2015).
- Hsu, C. C., et al. Universal plant phosphoproteomics workflow and its application to Tomato signaling in response to cold stress. Molecular & Cell Proteomics. 17 (10), 2068 (2018).
- Tsai, C. F., et al. Immobilized metal affinity chromatography revisited: pH/acid control toward high selectivity in phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 7 (9), 4058-4069 (2008).
- Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Molecular & Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).
- Ruprecht, B., et al. Comprehensive and reproducible phosphopeptide enrichment using iron immobilized metal ion affinity chromatography (Fe-IMAC) columns. Molecular & Cell Proteomics. 14 (1), 205-215 (2015).
- Sugiyama, N., et al. Phosphopeptide enrichment by aliphatic hydroxy acid-modified metal oxide chromatography for nano-LC-MS/MS in proteomics applications. Molecular & Cell Proteomics. 6 (6), 1103-1109 (2007).
- Tsai, C. F., et al. Sequential phosphoproteomic enrichment through complementary metal-directed immobilized metal ion affinity chromatography. Analytical Chemistry. 86 (1), 685-693 (2014).
- Zhou, H., et al. Enhancing the identification of phosphopeptides from putative basophilic kinase substrates using Ti (IV) based IMAC enrichment. Molecular & Cell Proteomics. 10 (10), (2011).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Dimayacyac-Esleta, B. R., et al. Rapid high-pH reverse phase stageTip for sensitive small-scale membrane proteomic profiling. Analytical Chemistry. 87 (24), 12016-12023 (2015).
- Wang, P., et al. Reciprocal regulation of the TOR Kinase and ABA receptor balances plant growth and stress response. Molecular Cell. 69 (1), 100-112 (2018).
- Lin, Z., et al. A RAF-SnRK2 kinase cascade mediates early osmotic stress signaling in higher plants. Nature Communications. 11 (1), 613 (2020).
- Humphrey, S. J., Azimifar, S. B., Mann, M. High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics. Nature Biotechnology. 33 (9), 990-995 (2015).
- Bekker-Jensen, D. B., et al. An optimized shotgun strategy for the rapid generation of comprehensive human proteomes. Cell Systems. 4 (6), 587-599 (2017).
- Possemato, A. P., et al. Multiplexed phosphoproteomic profiling using titanium dioxide and immunoaffinity enrichments reveals complementary phosphorylation events. Journal Proteome Research. 16 (4), 1506-1514 (2017).
- Hogrebe, A., et al. Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics. Nature Communications. 9 (1), 1045 (2018).
- Wong, M. M., et al. Phosphoproteomics of Arabidopsis Highly ABA-Induced1 identifies AT-Hook-Like10 phosphorylation required for stress growth regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2354-2363 (2019).
- Yang, F., Melo-Braga, M. N., Larsen, M. R., Jorgensen, H. J., Battle Palmisano, G. through signaling between wheat and the fungal pathogen Septoria tritici revealed by proteomics and phosphoproteomics. Molecular & Cell Proteomics. 12 (9), 2497-2508 (2013).
- Tsai, C. F., et al. Tandem Mass Tag labeling facilitates reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry analysis of hydrophilic phosphopeptides. Analytical Chemistry. 91 (18), 11606-11613 (2019).
