Phosphoproteomic Strategie zur Profilierung osmotischer Stresssignalisierung bei Arabidopsis
Summary
Präsentiert wird hier ein phosphoprotemischer Ansatz, nämlich Stop-and-Go-Extraktionsspitze Phosphoproteomic, die hohen Durchsatz und tiefe Abdeckung von Arabidopsis phosphoproteome bietet. Dieser Ansatz beschreibt den Überblick über osmotische Stresssignale in Arabidopsis.
Abstract
Die Proteinphosphorylierung ist entscheidend für die Regulierung der Enzymaktivität und der Genexpression unter osmottischen Bedingungen. Die Massenspektrometrie (MS)-basierte Phosphoproteomik hat die Art und Weise der Untersuchung der Pflanzensignaltransduktion verändert. Die Anforderung vieler Ausgangsstoffe und eine längere MS-Messzeit, um die Tiefe der Abdeckung zu erreichen, war jedoch der begrenzende Faktor für die Studie mit hohem Durchsatz globaler phosphoprotemischer Veränderungen in Pflanzen. Um die Empfindlichkeit und den Durchsatz von Pflanzenphosphoproteomik zu verbessern, haben wir einen Stop-and-Go-Extraktionsansatz (Stufen-)Spitzen-basierte Phosphoproteomik-Ansatz in Verbindung mit der Tandem Mass Tag (TMT)-Kennzeichnung für die schnelle und umfassende Analyse der Pflanzenphosphorylierungsstörung als Reaktion auf osmotischen Stress entwickelt. Unter Ausnutzung der Einfachheit und des hohen Durchsatzes der Bühnenspitzentechnik dauert das gesamte Verfahren etwa eine Stunde, indem zwei Tipps verwendet werden, um die Phosphopeptidanreicherung, Fraktionierung und Probenreinigungsschritte zu beenden, was auf eine benutzerfreundliche und hohe Effizienz des Ansatzes hindeutet. Dieser Ansatz bietet nicht nur eine eingehende Pflanzenphosphoproteomik-Analyse (> 11.000 Phosphopeptid-Identifikation), sondern zeigt auch die überlegene Trenneffizienz (< 5% Überlappung) zwischen benachbarten Fraktionen. Darüber hinaus wurde Multiplexing mit TMT-Etikettierung erreicht, um die phosphoproteomischen Veränderungen von Wildtyp- und Snrk2-Decuple-Mutantenpflanzen zu quantifizieren. Dieser Ansatz wurde erfolgreich verwendet, um die Phosphorylierungsereignisse von Raf-ähnlichen Kiinasen als Reaktion auf osmotischen Stress zu enthüllen, der Licht auf das Verständnis der frühen osmotischen Signalisierung in Landpflanzen wirft.
Introduction
Hoher Salzgehalt, niedrige Temperatur und Trockenheit verursachen osmotische Spannungen, was ein wichtiger Umweltfaktor ist, der die Pflanzenproduktivität beeinflusst1,2. Proteinphosphorylierung ist eine der bedeutendsten posttranslationalen Modifikationen, die Signalwahrnehmung und Transduktion in der pflanzlichen Reaktion auf osmotischen Stress3,4,5vermitteln. SNF1-bezogene Proteinkinase 2s (SnRK2s) sind an der osmotischen Stresssignalisierung6beteiligt. Neun von zehn Mitgliedern der SnRK2-Familie zeigen eine signifikante Aktivierung als Reaktion auf osmotischen Stress7,8. Die snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple (snrk2-dec) Mutant mit Mutationen in allen zehn SnRK2 zeigte Überempfindlichkeit gegen osmotischen Stress. Bei snrk2-dec Mutant sind die osmotische Stress-induzierte Akkumulation von Inositol 1,4,5-Trisphosphat (IP3), Abscisinsäure (ABA) Biosynthese und Genausdrücke stark reduziert, was die wichtige Rolle von SnRK2s bei osmotischen Stressreaktionenunterstreicht 6. Es ist jedoch noch unklar, wie SnRK2s-Kiinasen diese biologischen Prozesse regulieren. Die Profilierung der phosphoprotemischen Veränderungen als Reaktion auf osmotischen Stress ist eine effiziente Möglichkeit, diese Lücke zu überbrücken und die osmotischen spannungsgesteuerten Abwehrmechanismen in Pflanzen abzuleiten.
Die Massenspektrometrie (MS) ist eine leistungsfähige Technik zur Kartierung von Pflanzenphosphoproteome9. Die Charakterisierung der Pflanzenphosphoproteomik bleibt jedoch aufgrund des Dynamikbereichs des Pflanzenproteoms und der Komplexität des Pflanzenlysats4eine Herausforderung. Um diese Herausforderungen zu meistern, haben wir einen universellen pflanzlichen phosphoproteomischen Arbeitsablauf entwickelt, der unerwünschte Interferenzen wie photosynthetische Pigmente und Sekundärmetaboliten eliminiert und die tiefe Abdeckung von Pflanzenphosphoproteom10ermöglicht. Mehrere Phosphopeptidanreicherungsmethoden wie die immobilisierte Metallionenaffinitätschromatographie (IMAC) und die Metalloxidchromatographie (MOC) wurden für die Anreicherung von Phosphopeptiden vor der MS-Analyse11,12,13,14,15,16entwickelt. Saure Nicht-Phosphopeptide, die mit Phosphopeptiden koreinigen, sind die Hauptstörungen für den Phosphopeptidnachweis. Zuvor haben wir den pH-Wert und die organische Säurekonzentration des IMAC-Ladepuffers standardisiert, um die Bindung von Nichtphosphopeptiden zu eliminieren, um eine Anreicherungsspezifität von mehr als 90 % zu erhalten, die den Vorfraktionierungsschritt11umgeht.
Der Probenverlust im mehrstufigen Prozess der Phosphopeptidanreicherung und -fraktionierung behindert die Empfindlichkeit der Phosphopeptid-Identifikation und die Tiefe der phosphoproteomischen Abdeckung. Stop-and-Go-Extraktionsspitzen (Stufenspitzen) sind Pipettenspitzen, die kleine Scheiben enthalten, um das Ende der Spitze zu kappen, die mit Chromatographie für Peptidfraktionierung und Reinigung17integriert werden können. Der Probenverlust während des Stufenspitzenverfahrens kann minimiert werden, indem eine Probenübertragung zwischen den Rohren vermieden wird. Wir haben erfolgreich Bühnenspitze in Ga3 +-IMAC und Fe3+-IMAC implementiert, um niedrig reichlich reichlich phosphorylierte Peptide von einzeln phosphorylierten Peptiden zu trennen, die die Tiefe des menschlichen Phosphoproteloms15verbesserten. Darüber hinaus hat die Verwendung von High pH-Umkehrphasen (Hp-RP) Stufenspitze die breitere Abdeckung des menschlichen Membranproteoms im Vergleich zu der von starkem Kationenaustausch (SCX) und starker Anionenaustausch (SAX) Chromatographie18gezeigt. Daher kann die Integration von IMAC- und Hp-RP-Stufenspitzentechniken die Abdeckung von Pflanzenphosphoprotelom mit Einfachheit, hoher Spezifität und hohem Durchsatz erhöhen. Wir haben gezeigt, dass diese Strategie mehr als 20.000 Phosphorylierungsstellen von Arabidopsis Sämlingen identifiziert hat, was eine erhöhte Tiefe des pflanzlichen Phosphoproteloms19darstellt.
Hier berichten wir über ein phosphoproteomisches Protokoll zur Phosphoprotemik-Profilierung in Arabidopsis. Dieser Arbeitsablauf wurde angewendet, um die phosphoprotemische Störung von Wildtyp- und snrk2-dec mutierten Sämlingen als Reaktion auf osmotischen Stress zu untersuchen. Die phosphoproteomische Analyse ergab die Phosphorylierungsstellen, die an der Kinaseaktivierung und der frühen osmotischen Stresssignalisierung beteiligt sind. Die vergleichende Analyse von Wildtyp- und Snrk2-dec-Mutationsphosphoproteom-Daten führte zur Entdeckung einer Raf-ähnlichen Kinase (RAF)-SnRK2-Kinase-Kaskade, die eine Schlüsselrolle bei der Osmore-Stresssignalisierung in hohen Pflanzen spielt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Dynamikumfang und die Komplexität von Pflanzenproteom und Phosphoproteom sind nach wie vor ein begrenzender Faktor für die Tiefe der Phosphoproteomik-Analysen. Trotz der Fähigkeit der Single-Run-LC-MS/MS-Analyse, 10.000 Phosphorylierungsstellen21,22zu identifizieren, ist die Abdeckung des gesamten Pflanzlichen Phosphoproteloms immer noch begrenzt. Daher ist ein phosphoprotemischer Workflow erforderlich, der eine hohe Empfindlichkeit und überlegene Trennef…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das Strategic Priority Research Program der Chinesischen Akademie der Wissenschaften, Grant XDB27040106, unterstützt.
Materials
| 1.5 mL tube | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes |
| 200 µL pipet tip | Gilson | F1739311 | |
| 2-chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| ammonium phosphate monbasic | Sigma-Aldrich | 216003 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| blunt-ended needle | Hamilton | 90516 | Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16 |
| C18-AQ beads | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µm | |
| C8 Empore disk | 3 M | 2214 | 47 mm |
| Centrifuge | eppendorf | 22620444 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | CX1058 | |
| data analysis software | Perseus 1.6.2.1 | https://maxquant.net/perseus/ | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid | Sigma-Aldrich | 5330020050 | |
| Frits | Agilent | 12131024 | Frits for SPE Cartridges |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | |
| H2O | Sigma-Aldrich | 1153334000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| LTQ-orbitrap | Thermo Fisher Scientific | Velos Pro | |
| mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | LTQ-Orbitrap Velos Pro | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| nano LC | Thermo Fisher Scientific | Easy-nLC 1000 | |
| Ni-NTA spin column | Qiagen | 31014 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| plunger | Hamilton | 1122-01 | Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 μl) |
| search engine software | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
| SEP-PAK Cartridge 50 mg | Waters | WAT054960 | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SPD121P | |
| TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Triethylammonium bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 |
Riferimenti
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