אסטרטגיה פוספוטומית ליצירת פרופיל של איתות מתח אוסמוטי ב- Arabidopsis
Summary
מוצג כאן היא גישה זרחנית, כלומר לעצור וללכת מיצוי קצה מבוסס פוספופרוטומית, אשר מספק תפוקה גבוהה כיסוי עמוק של ערבידופסיס phosphoproteome. גישה זו מתווה את הסקירה של איתות מתח אוסמוטי ב Arabidopsis.
Abstract
זרחון חלבונים חיוני לוויסות פעילות אנזימים וביטוי גנים במצב אוסמוטי. ספקטרומטריית מסה (MS) מבוססת פוספופרוטאימיקה שינתה את הדרך לחקר התמרת אותות הצמח. עם זאת, הדרישה של הרבה חומרים התחלתיים וזמן מדידה ממושך של טרשת נפוצה כדי להשיג את עומק הכיסוי הייתה הגורם המגביל למחקר התפוקה הגבוהה של שינויים פוספופרוטאיים גלובליים בצמחים. כדי לשפר את הרגישות והתפוקה של phosphoproteomics הצמח, פיתחנו לעצור וללכת מיצוי (שלב) טיפ מבוסס זרחן גישה בשילוב עם תג מסה טנדם (TMT) תיוג לניתוח מהיר ומקיף של הפרעה זרחון הצמח בתגובה ללחץ אוסמוטי. מינוף הפשטות והתפוקה הגבוהה של טכניקת קצה הבמה, ההליך כולו לוקח כשעה באמצעות שני טיפים כדי לסיים העשרת פוסופפטיד, שברים, וצעדי ניקוי מדגם, מה שמרמז על קל לשימוש ויעילות גבוהה של הגישה. גישה זו לא רק מספקת ניתוח מעמיק של פוספופרוטאימיקה של הצמח (> 11,000 זיהוי פוסופפטיד) אלא גם מדגימה את יעילות ההפרדה המעולה (חפיפה של 5%) בין שברים סמוכים. כמו כן, מולטיפלקסים הושגו באמצעות תיוג TMT כדי לכמת את השינויים הפוספופרוטאיים של צמחים מוטנטים מסוג בר ו snrk2 decuple. גישה זו שימשה בהצלחה כדי לחשוף את אירועי זרחון של קינאזים דמויי רף בתגובה ללחץ אוסמוטי, אשר שופך אור על ההבנה של איתות אוסמוטי מוקדם בצמחים יבשתיים.
Introduction
מליחות גבוהה, טמפרטורה נמוכה ובצורת גורמים ללחצים אוסמוטיים, המהווים גורם סביבתי מרכזי המשפיע על תפוקת הצמח1,2. זרחון חלבונים הוא אחד השינויים המשמעותיים ביותר לאחר התרגום המתווכים את תפיסת האות והתמרה בתגובת הצמח ללחץ אוסמוטי3,4,5. קינאז חלבון הקשורים SNF1 2s (SnRK2s) מעורבים הלחץ אוסמוטי איתות6. תשעה מתוך עשרה בני משפחת SnRK2 מראים הפעלה משמעותית בתגובה ללחץ אוסמוטי7,8. snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple(snrk2-dec)מוטציות בכל עשר SnRK2 הציג רגישות יתר ללחץ אוסמוטי. ב מוטציה snrk2-dec, הצטברות אוסמוטית הנגרמת על ידי מתח של אינוזיטול 1,4,5-trisphosphate (IP3),חומצה אבסיסית (ABA) ביוסינתזה, ביטויים גנים מופחתים מאוד, המדגיש את התפקיד החיוני של SnRK2s בתגובות מתח אוסמוטי6. עם זאת, עדיין לא ברור כיצד SnRK2s kinases לווסת תהליכים ביולוגיים אלה. פרופיל השינויים הפוספופרוטאיים בתגובה ללחץ אוסמוטי הוא דרך יעילה לגשר על פער זה ולתוות את מנגנוני ההגנה המופעלים על ידי מתח אוסמוטי בצמחים.
ספקטרומטריית מסה (MS) היא טכניקה רבת עוצמה למיפוי זרחן צמחי9. אפיון של זרחן הצמח, עם זאת, להישאר אתגר בשל הטווח הדינמי של פרוטאום הצמח ואת המורכבות של הצמח lysate4. כדי להתגבר על אתגרים אלה, פיתחנו זרימת עבודה פוספופרוטאומית צמחית אוניברסלית, המבטלת הפרעות לא רצויות כגון מפיגמנטים פוטוסינתטיים ומטבוליטים משניים, ומאפשרת כיסוי עמוק של זרחן צמחי10. מספר שיטות העשרה זרחן כגון כרומטוגרפיה יון מתכת משותק (IMAC) ו כרומטוגרפיה תחמוצת מתכת (MOC) פותחו להעשרת פוסופפטידים לפני ניתוח MS11,12,13,14,15,16. חומצי שאינו פוסופפטידים שיתוף טיהור עם פוסופפטידים הם ההפרעות העיקריות לגילוי פוסופפטיד. בעבר, תקננו את ערך החומציות החומצות האורגניות ואת ריכוז החומצה האורגנית של מאגר הטעינה של IMAC כדי למנוע את האיגוד של שאינם פוסופפטידים, כדי להשיג יותר מ -90% ספציפיות העשרה לעקוף את שלב טרום השבר11.
אובדן מדגם בתהליך רב-שלבי של העשרת פוסופפטיד ושברים מקשה על הרגישות של זיהוי פוסופפטיד ועומק הכיסוי הזרחני. טיפים לעצירה ומיצוי (טיפים לשלב) הם טיפים פיפטה המכילים דיסקים קטנים כדי לכסות את סוף הקצה, אשר ניתן לשלב עם כרומטוגרפיה עבור שבר פפטיד וניקוי17. אובדן מדגם במהלך הליך קצה הבמה ניתן למזער על ידי הימנעות העברה מדגם בין הצינורות. יישמנו בהצלחה טיפ שלב Ga3 +-IMAC ו Fe3 +-IMAC להפריד פפטידים מרובים פוספורילאטים בשפע נמוך מן פפטידים phosphorylated סינגלינג, אשר שיפר את עומק phosphoproteome אנושי15. בנוסף, השימוש ב- pH גבוה הפוך שלב (Hp-RP) שלב עצה הוכיחה את הכיסוי הרחב יותר של פרוטאום קרום אנושי לעומת זה של חילופי קטיון חזק (SCX) ו חזק חילופי אניון (SAX) כרומטוגרפיה18. לכן, שילוב IMAC וטכניקות קצה שלב Hp-RP יכול להגדיל את כיסוי phosphoproteome הצמח עם פשטות, ספציפיות גבוהה, תפוקה גבוהה. הוכחנו כי אסטרטגיה זו זיהתה יותר מ -20,000 אתרי זרחן משתילי ערבידופסיס, המייצגים עומק משופר של זרחן צמחי19.
כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול פוספופרוטאיומי מבוסס קצה שלב עבור אפיון זרחני ב Arabidopsis. זרימת עבודה זו הוחלה כדי לחקור את ההפרעה הזרחנית של שתילים מוטנטים מסוג בר ו snrk2-dec בתגובה ללחץ אוסמוטי. הניתוח הזרחני חשף את אתרי הזרחן מעורבים בהפעלת קינאז ואיתות מתח אוסמוטי מוקדם. ניתוח השוואתי של נתוני זרחן מוטנטים מסוג Wild ו-snrk2-dec הוביל לגילוי מפל קינאז דמוי רף (RAF)-SnRK2 קינאז, הממלא תפקיד מפתח באיתות מתח אוסמור בצמחים גבוהים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הטווח הדינמי והמורכבות של פרוטאום צמחים ופוספופרוטום הם עדיין גורם מגביל לעומק ניתוחי הפוספופרוטומיקה. למרות היכולת של ניתוח LC-MS/MS חד פעמי לזהות 10,000 אתרי זרחון21,22, הכיסוי של זרחן הצמח כולו עדיין מוגבל. לכן, נדרשת זרימת עבודה זרחנית המספקת רגישות גבוהה ויעיל…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר בעדיפות אסטרטגית של האקדמיה הסינית למדעים, גרנט XDB27040106.
Materials
| 1.5 mL tube | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes |
| 200 µL pipet tip | Gilson | F1739311 | |
| 2-chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| ammonium phosphate monbasic | Sigma-Aldrich | 216003 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| blunt-ended needle | Hamilton | 90516 | Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16 |
| C18-AQ beads | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µm | |
| C8 Empore disk | 3 M | 2214 | 47 mm |
| Centrifuge | eppendorf | 22620444 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | CX1058 | |
| data analysis software | Perseus 1.6.2.1 | https://maxquant.net/perseus/ | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid | Sigma-Aldrich | 5330020050 | |
| Frits | Agilent | 12131024 | Frits for SPE Cartridges |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | |
| H2O | Sigma-Aldrich | 1153334000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| LTQ-orbitrap | Thermo Fisher Scientific | Velos Pro | |
| mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | LTQ-Orbitrap Velos Pro | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| nano LC | Thermo Fisher Scientific | Easy-nLC 1000 | |
| Ni-NTA spin column | Qiagen | 31014 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| plunger | Hamilton | 1122-01 | Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 μl) |
| search engine software | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
| SEP-PAK Cartridge 50 mg | Waters | WAT054960 | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SPD121P | |
| TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Triethylammonium bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 |
Riferimenti
- Hasegawa, P. M., Bressan, R. A., Zhu, J. K., Bohnert, H. J. Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annual Review Plant Physiology Plant Molecualr Biology. 51, 463-499 (2000).
- Janmohammadi, M., Zolla, L., Rinalducci, S. Low temperature tolerance in plants: Changes at the protein level. Phytochemistry. 117, 76-89 (2015).
- Umezawa, T., Takahashi, F., Shinozaki, K. Phosphorylation networks in the abscisic acid signaling pathway. Enzymes. 35, 27-56 (2014).
- Silva-Sanchez, C., Li, H., Chen, S. Recent advances and challenges in plant phosphoproteomics. Proteomics. 15 (5-6), 1127-1141 (2015).
- Wang, P., et al. Mapping proteome-wide targets of protein kinases in plant stress responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (6), 3270-3280 (2020).
- Fujii, H., Verslues, P. E., Zhu, J. K. Arabidopsis decuple mutant reveals the importance of SnRK2 kinases in osmotic stress responses in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1717-1722 (2011).
- Wang, P., et al. Quantitative phosphoproteomics identifies SnRK2 protein kinase substrates and reveals the effectors of abscisic acid action. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (27), 11205-11210 (2013).
- Boudsocq, M., Barbier-Brygoo, H., Lauriere, C. Identification of nine sucrose nonfermenting 1-related protein kinases 2 activated by hyperosmotic and saline stresses in Arabidopsis thaliana. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41758-41766 (2004).
- Li, J., Silva-Sanchez, C., Zhang, T., Chen, S., Li, H. Phosphoproteomics technologies and applications in plant biology research. Frontiers in Plant Science. 6, 430 (2015).
- Hsu, C. C., et al. Universal plant phosphoproteomics workflow and its application to Tomato signaling in response to cold stress. Molecular & Cell Proteomics. 17 (10), 2068 (2018).
- Tsai, C. F., et al. Immobilized metal affinity chromatography revisited: pH/acid control toward high selectivity in phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 7 (9), 4058-4069 (2008).
- Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Molecular & Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).
- Ruprecht, B., et al. Comprehensive and reproducible phosphopeptide enrichment using iron immobilized metal ion affinity chromatography (Fe-IMAC) columns. Molecular & Cell Proteomics. 14 (1), 205-215 (2015).
- Sugiyama, N., et al. Phosphopeptide enrichment by aliphatic hydroxy acid-modified metal oxide chromatography for nano-LC-MS/MS in proteomics applications. Molecular & Cell Proteomics. 6 (6), 1103-1109 (2007).
- Tsai, C. F., et al. Sequential phosphoproteomic enrichment through complementary metal-directed immobilized metal ion affinity chromatography. Analytical Chemistry. 86 (1), 685-693 (2014).
- Zhou, H., et al. Enhancing the identification of phosphopeptides from putative basophilic kinase substrates using Ti (IV) based IMAC enrichment. Molecular & Cell Proteomics. 10 (10), (2011).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Dimayacyac-Esleta, B. R., et al. Rapid high-pH reverse phase stageTip for sensitive small-scale membrane proteomic profiling. Analytical Chemistry. 87 (24), 12016-12023 (2015).
- Wang, P., et al. Reciprocal regulation of the TOR Kinase and ABA receptor balances plant growth and stress response. Molecular Cell. 69 (1), 100-112 (2018).
- Lin, Z., et al. A RAF-SnRK2 kinase cascade mediates early osmotic stress signaling in higher plants. Nature Communications. 11 (1), 613 (2020).
- Humphrey, S. J., Azimifar, S. B., Mann, M. High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics. Nature Biotechnology. 33 (9), 990-995 (2015).
- Bekker-Jensen, D. B., et al. An optimized shotgun strategy for the rapid generation of comprehensive human proteomes. Cell Systems. 4 (6), 587-599 (2017).
- Possemato, A. P., et al. Multiplexed phosphoproteomic profiling using titanium dioxide and immunoaffinity enrichments reveals complementary phosphorylation events. Journal Proteome Research. 16 (4), 1506-1514 (2017).
- Hogrebe, A., et al. Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics. Nature Communications. 9 (1), 1045 (2018).
- Wong, M. M., et al. Phosphoproteomics of Arabidopsis Highly ABA-Induced1 identifies AT-Hook-Like10 phosphorylation required for stress growth regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2354-2363 (2019).
- Yang, F., Melo-Braga, M. N., Larsen, M. R., Jorgensen, H. J., Battle Palmisano, G. through signaling between wheat and the fungal pathogen Septoria tritici revealed by proteomics and phosphoproteomics. Molecular & Cell Proteomics. 12 (9), 2497-2508 (2013).
- Tsai, C. F., et al. Tandem Mass Tag labeling facilitates reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry analysis of hydrophilic phosphopeptides. Analytical Chemistry. 91 (18), 11606-11613 (2019).
